Autor Thema: Umbau Auflichtmikroskop->Epi-Floureszenzmikroskop mit LED-SIM Structured Ill.Mic  (Gelesen 6009 mal)

Clipsee

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Hallo Zusammen,

das Vorhaben klingt tatsächlich etwas gewagt. Der Aufbau ist fertig und an ein Leitz HM 3 adaptiert. Die Komponenten sind die folgenden:

LED: Luxeon Royal Blue 445 nm Center-Wavelength
Strahlteiler: Dichroitischer Spiegel aus einem Beamer, Reflektiert sehr gut das blau und lässt grün durch (Wellenlänge ist leider unbekannt)
Sperrfilter: 525 nm
Mikroskop: Leitz HM Lux 3, 4x, 10x, 20x, 100x (1,32 Oel).
Linsen: Unspezifizierte Linsen, hauptsächlich aus alten Beamern
Kamera: Panasonic Lumix G1

Die Ausleuchtung in der Probenebene sieht schon gut aus. Köhlern ist noch nicht ganz möglich, kommt aber noch.

Meine Frage die sich nun ergibt - was ich anfänglich eigentlich als einfach vorhergesagt hatte - Was kann ich für Proben verwenden um das Mikroskop mal zu testen? Ich hatte mich bei der Auslegung auf GFP (Green Flourescent Protein) festgelegt. Bzw irgendeine Probe, die ihr Emissionsmaximum bei etwa 450 nm liegt. Nun - nachdem das System fertig ist - stelle ich fest, dass es gar nicht so einfach ist an so eine Probe zu kommen. Gibt es irgendeine Möglichkeit solche Proben herzustellen? Hat jemand Erfahrung mit der Floureszenzmikroskopie?
http://people.umass.edu/rossj/OpticsforBiophysics_files/Ross-AJP-Optics.pdf Hier die Epi-Fluoreszenz ganz gut beschrieben. Ein Aufbau befindet sich ganz unten.
Hier ist ein anderer Umbau
http://54.165.141.74/wbg/articles/volume-18-number-1/using-leds-as-a-low-cost-source-to-detect-gfp-and-dsred-2/


Ein weiteres Ziel ist es weiter eine strukturierte Beleuchtung zu realisieren, um die Auflösungsgrenze der Objektive (welche leider nicht so super abbildungsleistungen haben) zu verbessern. Unterm Strich soll ein günstiges "DIY"-Flourescenc-Mikroskop rauskommen, was mithilfe der SIM gute Bilder hervorbringt. Hierzu wird das sich im Fourierraum ergebende Bild durch Variation der Beleuchtungsmuster, aneinander gehängt und zurück in den Bildbereich transformiert. Im Idelfall bekommt man eine doppelte Auflösung, da die effektive NA numerisch verdoppelt wird.

Vielleicht hat jemand einen Ratschlag was Quellen im Internet angeht :)


Vielen Dank im Voraus!
Bene

JB

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Re: Umbau Auflichtmikroskop->Epi-Floureszenzmikroskop mit LED-SIM Structured Ill.Mic
« Antwort #1 am: Januar 09, 2015, 21:19:43 Nachmittag »
Hallo,

Ich vermute, dass sich mit Wacker gefaerbte Pflanzenschnitte als Dauerpraeparate ganz gut dafuer eignen: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=11552.msg85308#msg85308

Wenn sie tatsaechlich SIM realisieren wollen, dann sollte der Rest des Versuchsaufbaus aber auch optimiert sein. Ansonsten packen Sie Fehlerquellen auf Fehlerquellen und am Ende sieht man den Effekt der SIM gar nicht mehr (wie auch immer das gehen soll).

Ich will hier nicht schwarzsehen, aber folgende Probleme sollten schon fuer normale Fluoreszenz bedacht werden:

- Einwandfreie Objektive mit hoher NA
- Korrekte Tubuslaenge des Mikroskops (Sie haben den selbstgebauten Beleuchtungssatz oben am Mikroskop montiert; ist dabei die richtige Tubuslaenge erhalten geblieben oder durch entsprechende Tubuslinsen wieder hergestellt worden?)
- Ausreichend helle Fluoreszenz erfordert einen entsprechenden Fluoreszenzkondensor (bei Auflichtfluoreszenz dient das Objektiv als Kondensor, aber der Kollektor etc. muss das Anregungslicht erst einmal bis dorthin bringen)
- Die Filter muessen entsprechend hochwertig sein (gute Ausloeschung, planparallele Glasflaechen; deshalb sind neue Fluoreszenzfilter auch so teuer)
- Rauscharme Kamera

Es waere vielleicht einfacher, wenn Sie einen gebrauchten Auflicht-Fluoreszenzkondensor aus Ausgangspunkt fuer die Bastelarbeiten mit SIM nehmen wuerden. Wenn Sie naemlich erst einmal die optimalen Objektive (Fluorit oder Apo), Filter und Kamera zusammen haben, sind Sie auch ohne SIM in der Lage gute Bilder zu machen.

Beste Gruesse, Jon

Clipsee

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Re: Umbau Auflichtmikroskop->Epi-Floureszenzmikroskop mit LED-SIM Structured Ill.Mic
« Antwort #2 am: Januar 10, 2015, 14:21:39 Nachmittag »
Vielen Dank für die ausführliche Antwort! Ich werde mich nach den Präparaten mal erkundigen.

Was den Aufbau angeht, da bin ich mir selbst noch nicht so sicher, ob es überhaupt funktioniert. Der Aufbau für den DLP-Projektor ist relativ einfach. Es erfolgt eine Abbildung des Spiegeldisplays (PicoBeamer Samsung MBP200 - Defekt Ebay 25 Euro) mithilfe einer Linse (f=30) ins Zwischenbild des Mikroskopojektivs. Laut Sehfeldzahl (beiliegendes Okular) sollte dieses 18mm im Durchmesser haben. In dieser Ebene habe ich eine Feldlinse platziert, die die kurze Abbildungsbrennweite (f=30) in die rückseitige Apertur des MOs (Dep=2*NA*f') abbildet. Wenn alle Komponenten auf der optischen Achse liegen ergibt sich ein gutes Streifenmuster in der PRobenebene. Sogar einigermaßen Homogen.

Der Beamer stellt die Feldblende dar. Die Aperturblende hab ich noch nicht platziert. Die Halterungen hab ich 3D gedruckt, funktioniert sogar ganz gut! ;)
Was den Dichroiden angeht, weiß ich nicht genau, wie ich die "Qualität" beurteilen soll. Er reflektiert blau und passiert grün ;)..

Mein Ziel ist es ein günstiges Mirkoskop zu bauen, was eine hohe Auflösung hat. Alles so günstig wie möglich mit Komponenten, die man schnell bekommt bzw. irgendwo rumfliegen hat.




Anbei ein Bild mit der Rechnung und von dem ersten Versuchsaufbau von dem Mikroskop.

https://www.dropbox.com/s/5twp58o4xsllfrv/2015-01-06%2023.36.35.jpg?dl=0 - Mikroskop
https://www.dropbox.com/s/um76ahmhz32dqtb/Foto.JPG?dl=0 - Strahlengang



MFG
Bene

PS: Wenn ich die Tage mal Zeit habe, dann schreiben ich mal was mit mehr Bildern in meinen Blog :)

JB

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Re: Umbau Auflichtmikroskop->Epi-Floureszenzmikroskop mit LED-SIM Structured Ill.Mic
« Antwort #3 am: Januar 10, 2015, 17:44:25 Nachmittag »
Hallo Bene,

Das sieht interessant aus. Zu den Berechnungen kann ich nichts sagen. Die Kamera ist (?) ja so montiert, dass das Zwischenbild direkt auf den Chip projieziert wird. Solang der Abstand zwischen Objektiv und Kamerachip um die 150 mm (+/- vielleicht 8 mm) betraegt sollte es mit der Tubuslaenge keine Probleme geben.

Die Objektive erfordern eigentlich Leitz Periplan-Okulare zur Kompensation des Farbvergroesserungsfehlers (bei direkter Projektion fehlt das Okular). Solang Sie sich auf GFP beschraenken (monochrom gruen) ist das aber egal. Die achromatischen Objektive sind bei gruenem Licht auch ausreichend.

Das Einbringen von Spiegeln, insbesondere schraeg gestellten, ohne Telansystem (Unendlichraum) ist problematisch; das duerfte zu einer deutlichen Verschlechterung der Bildqualitaet fuehren - aber das koennen Sie ja selbst beurteilen.

Die mit Wacker gefaerbten Dauerpraeparate gibt es vermutlich nicht zu kaufen. Aber vielleicht koennen Ihnen die Mikroskopiker hier im Forum mit ein paar eingefaerbten Schnitten weiterhelfen, wenn Sie eine Anfrage im Mikromarkt stellen: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?board=5.0 Die Fluoreszenz ist gruen, gelb und rot; nicht wie GFP, aber schoen hell.

So geht es wohl auch: http://mikroskopie-forum.at/index.php/Thread/1095-Einfaches-Testobjekt-f%C3%BCr-die-Fluoreszenz/?postID=9453#post9453

Viel Erfolg, Jon
« Letzte Änderung: Januar 10, 2015, 21:54:45 Nachmittag von JB »

Clipsee

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Re: Umbau Auflichtmikroskop->Epi-Floureszenzmikroskop mit LED-SIM Structured Ill.Mic
« Antwort #4 am: Januar 12, 2015, 22:25:43 Nachmittag »


Das Einbringen von Spiegeln, insbesondere schraeg gestellten, ohne Telansystem (Unendlichraum) ist problematisch; das duerfte zu einer deutlichen Verschlechterung der Bildqualitaet fuehren - aber das koennen Sie ja selbst beurteilen.

So geht es wohl auch: http://mikroskopie-forum.at/index.php/Thread/1095-Einfaches-Testobjekt-f%C3%BCr-die-Fluoreszenz/?postID=9453#post9453

Viel Erfolg, Jon


Vielen Dank für den tollen Tipp mit den Stiften. Genial! :)

Allerdings konnte ich mir heute auch noch eine "echte" Probe ausborgen und den Aufbau testen. Die Abbildung von dem DLP ist leider ausgesprochen schlecht. Gute Optiken haben da wohl doch ihren Preis. Ich habe mal Aufnahme hochgeladen. Die Kamera hat in JPG noch ein paar Farben dazugedichtet. In RAW ist es Grün. Interessant ;).. Für eine SIM Aufnahme reicht das natürlich noch lange nicht!

https://www.dropbox.com/s/jliqr368hthltk7/P1100770.JPG?dl=0

Mir ist aufgefallen, dass der Dichroit weniger Licht reflektiert als er sollte. Ich habe die LEDs von dem Beamer durch die Royal-Blue LED ausgetauscht.
Kennt jemand eine gute Quelle für Spiegel für einen speziellen Wellenlängenbereich? Hier habe ich welche gefunden, kommen allerdings aus Amerika: http://www.ebay.de/itm/Dichroic-Mirror-420DRLP-at-11-25-degrees-15-8mm-dia-/160550580391?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item25618f70a7


Viele Grüße
Bene

JB

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Re: Umbau Auflichtmikroskop->Epi-Floureszenzmikroskop mit LED-SIM Structured Ill.Mic
« Antwort #5 am: Januar 13, 2015, 00:43:56 Vormittag »
Hallo Bene,

Machen Sie zum Start doch auch einmal ein Bild von diesem Objekt im Durchlicht. Mit dem Spiegel und den Filtern dazwischen, und ohne Filter und Spiegel.

Der verlinkte Strahlenteiler hat zwei Probleme: zum einen ist die AOI (angle of incidence) 11.25 Grad (statt 45 Grad wie ueblich); zum anderen ist der Spiegel 3.2 mm dick, weil er fuer einen Laser gedacht ist. Filter hoher Qualitaet im Bildraum des Mikroskops sind meist erheblich duenner. So ein dicker Spiegel verursacht Probleme wenn er im 45 Grad-Winkel ohne Telansystem eingebracht wird.

Beste Gruesse, Jon