Fragen zu Fixierung und Lagerung

Begonnen von Nora, Januar 26, 2015, 09:57:51 VORMITTAG

Vorheriges Thema - Nächstes Thema

Nora

Liebes Forum,

nachdem ich nun endlich beim Fixieren angekommen bin, tun sich mir verschiedene Fragen auf, wie folgt:

1. Ich experimentiere gerade mit Bouin (Pikrinsäure, Formol, Eisessig)
- was passiert, wenn die Pikrinsäure nicht vollständig ausgewaschen sein sollte? Es gehen "keine Farbwolken mehr ab" wie es immer so schön heißt, aber ich habe gerade sehr durchscheinendes Gewebe und sehe daß es an dickeren Stellen innen noch gelb ist. Würde das beim Einbetten/Schneiden/Färben irgendetwas ausmachen?
- Löst sich Pikrinsäure ggf auch in Isopropanol? Oder ist es besser in 70%EthOH fertig zu waschen?

2. Im Romeis 17. auflage steht, daß "auch monatelanges Liegen in der Lösung nicht schädlich ist", in der aktuellen Ausgabe finde ich nichts dazu? In der Wikipedia steht dagegen "Ungetrocknete Gewebe sollten weniger als 24 Stunden in Bouin-Lösung fixiert werden".
Ja was denn nun?
Ich probiere mit der Mischung ua um gleich dabei zu entkalken, also das wäre für mich nicht das Problem.

3. Ist es besser, die fixierten Gewebe im Kühlschrank in der Fixierlösung (ich habe aktuell 5% Formalin bzw eben Bouin) zu lagern, oder fertig gewaschen in 70% EthOH? Letzteres ist hier im Haus wohl Usus, die Proben die ich allerdings bisher in dieser Form bekam, schienen mir etwas... flusig, wie soll man sagen, nicht mehr wirklich schön, etwas degradiert, in beginnender Auflösung begriffen. Vielleicht wurde auch nicht ausreichend fixiert, das kann ich leider nicht sagen, aber könnte es daran liegen?
Das Lagern ist zum einen notwendig wenn mal mehr Material anfällt bzw andere dringendere Aufgaben, als ich dann frisch abarbeiten kann, und zum anderen soll von manchen Sachen immer was auf Vorrat sein, für Studenten/Praktikum usw. Von dem her neige ich ja zu der Ethanollösung, weils dann eben wirklich ready to use ist, aber wie gesagt, mir scheint das nicht unbedingt dem Erhalt des Gewebes förderlich? Erfahrungen, Tips?

Mit schonmal dankbaren Grüßen,

Nora

Nora

Ergänzung: Ich habe nun auch im neuen Romeis gefunden, daß für einige Wochen im Fixans (inkl Bouin) gelagert werden kann, allerdings stehen keine Alternativen dabei, und auch nicht was man tut wenn man länger lagern möchte?

und: Was ist zum Entkalken (ich habe etwa Schwämme und Korallenpolypen mit Kalknadeln) besonders geeignet bzw empfehlenswert? Außer Pikrinsäure?

Ronald Schulte

Nora,

Du hast viele fragen wo ich nicht alles beantworten kann aber doch einiges wo ich selber Erfahrung mit habe.
Bouin ist eine sehr gute Fixierung besonders für Übersicht Färbungen. Fast alle Färbungen sind durch zu fuhren. Besondere Färbungen wie z.B. Versilberungen oder DNS Färbungen geht nicht mehr, da ist Formalin oder Mischungen von Formalin mit Methanol besser geeignet.

1.   Um das Fixativ völlig aus zu waschen ist fast unmöglich und muss auch nicht. Wenn ich mein Gewebe aus Bouin einbette ist es immer noch Gelblich. Das kann man schön erkennen wenn den Schnitt aufgezogen ist im Vergleich mit Formol Fixiertes Gewebe. Den Formolschnitt ist dann fast Weiß und den Bouin Schnitt leicht Gelb. Wichtig ist wohl das du bei die Bewässerung, nachdem das Paraffin mit Xylen entfernt ist, die Schnitte lange genug in Ethanol stehen lässt und ab und zu mal den OT bewegst. Du wirst dann sehen das in die 85 und 70%-iger Ethanol Stufen das Ethanol leicht Gelb wird und den Schnitt völlig weiß und gut durchscheinend wird. In Wasser angekommen kannst du den Schnitt dann fast nicht mehr erkennen. Darum musst du unbedingt die Kante von den OT beschriften weil du sonst nicht mehr erkennen kannst wo sich den Schnitt befindet. Ist nicht das erste mal das ein OT gereinigt wird mit Tissue wo sich den Schnitt an die Unterseite von das OT befindet!
Du kannst sehr gut anschließend an die Xylen Stufe in 100% 2-Propanol anfangen mit Wässern aber in die Stufe löst sich das Picrinsäure noch nicht so gut, das fängt erst an in die 85 und 70% Stufen.

2.   Im Romeis 18 Auflage ist vieles weggelassen was im 17 Auflage geschrieben ist. Darum ist es sinnvoll um beide zu haben.
Ich lasse meine Proben die auch schon etwas Kalk in sich haben (Junge Mauser von einige Tagen alt) so zwei bis drei Monaten im Fixativ. Das schadet absolut nicht und hat das große Vorteil das es entkalkend wirkt, ist ja Ideal. Das Gewebe wird wohl was härter aber bleibt noch immer sehr einfach zu schneiden. War es zuerst so sanft das es nicht Trimmbar war, jetzt kannst du es sehr leicht in die Brocken schneiden wie du es haben möchtest.

3.   Wenn du Fixierte Proben aufbewahren möchtest ist es sinnvoll um das in 70-80% 2-Propanol zu machen. Auswaschen in 70% Ethanol also nicht in Wasser und nicht in 50% Ethanol (das weil sonst das Bindegewebe aufschwellt). Das Ethanol einige malen erneuern und so wascht sich das Picrinsäure mehr und mehr aus. Nach einige zeit kannst du es dann lagern in 70-80% 2-Propanol. Bleibt aber leichtgelb.

Grüße Ronald
Mikroskope:
Leitz Orthoplan (DL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotom:
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

Ronald Schulte

Zugabe,

Ins besondere wenn du z.B. die ,van Gieson' Färbung durchfuhren mochtest ist es sehr wichtig das alle Picrinsäure aus den Schnitt gewaschen ist.  Das ist den Grund das die Färbung meist schnell ausbleicht. Dazu ist den Ansatz mit Thiazin auch besser wie mit Fuchsin.

Gruße Ronald
Mikroskope:
Leitz Orthoplan (DL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotom:
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

Nora

Lieber Ronald,

herzlichen Dank für Deine erhellenden Antworten und guten Tips!
Leider hatte ich viel zu tun und bin nicht zum Schreiben gekommen, und einige weitere Frage die sich mir aufgetan haben hab ich schon wieder vergessen... Dann waren sie wohl nicht so wichtig. :D
Das mit dem 70%Isopropanol werd ich so machen, scheint mir sinnvoll. Vielleicht stell ich parallel ein paar Proben in 70% EtOH, und schau ob ich in ein paar Wochen/Monaten Unterschiede erkennen kann.
Färben tu ich momentan mit HE bzw basischem Fuchsin und Toluidin O, ist aber beides noch nicht so toll überzeugend, muß ich noch weiter experimentieren. Das Toluidin scheint es in der aufsteigenden Alkoholreihe wieder auszuwaschen(?), und das Mayersche Hämalaun, das ich noch von meiner Vorgängerin gefunden habe, ist vielleicht schon zu alt? Ist eine fertige käufliche Mischung. Hm.

Stimmt, da ist gleich doch noch eine Frage die ich hatte: In den Anleitungen steht, man soll die Bouinsche Lösung immer frisch ansetzen, ich habe hier allerdings eine Flasche käufliche, fertige Mischung von Morphisto stehn, die wahrscheinlich auch schon mindestens ein Jahr "offen" (also die Flasche war schonmal geöffnet worden, war aber natürlich zu) stand. Soweit ich sehn konnte scheint das der Fixierung keinen Abbruch getan zu haben? Was passiert wenn die Lösung länger steht, warum soll man sie immer frisch anrühren?

Und dann noch was:
Ich habe hier aktuell Büschelchen von kleinen Korallenpolypen, die Polypen sind maximal etwa 1cm lang, der Stiel 1mm im Durchmesser, der Armkranz etwa auch einen 1cm bei den Großen, ist alles sehr weich und zart und "schlabberig". Sie haben kleinste Kalknadeln, die ich einmal mit Bouin eben aufgelöst habe, und einmal zum Vergleich nur mit Formol fixiert und dann mit 20%EDTA entkalkt habe. So. Nun wird Bouin ja mit 70% EtOH ausgewaschen, danach war mein Büschel immernoch schön weich und flexibel. Wollte ich weiter entwässern und hab es direkt in Isopropanol getan, ist plötzlich alles zusammengeschnurrt und bockhart geworden, ich kann die einzelnen Polypen nicht mehr aus dem Klumpen separieren. Also hab ich beim nächsten nach dem Waschen erst die Polypen rausgeschnitten und meine entsprechenden Gewebestückchen geschnitten und dann in Isoprop, daß sie hart wurden war bei den kleinen Stückchen vermutlich sogar dann von Vorteil weil sie sich besser im Parafin ausrichten ließen. Die Formolpolypen hab ich normal mit Wasser ausgewaschen, und zusammen mit anderen sehr langsam entwässert, indem ich immerwieder mal ein paar ml 50%EtOH ins Wasser zugegeben habe. Dann in frischen 50%EtOH, da waren sie auch noch schön weich, habe 70%EtOH zugetropft, da lösten sich Farbstoffe aus der einen Koralle, drum hab ich sie separiert und dachte, nun sind sie schon soweit entwässert, wenn ich sie in reinen 70%EtOH werfe sollte nichts mehr passieren. Haha, sie sind wieder zu einem harten Klumpen zusammengeschrumpft. >:( :o ??? :-\
Warum bleiben die Bouinpolypen in 70%EtOH weich, die FormolEDTApolypen nicht? Die Korallen so zu lagern ist sinnfrei, und sie vorher zu schneiden auch nicht immer sinnvoll da ich nicht weiß wer wann was davon wie braucht. In nur 50% EtOH/Isopropanol lagern? Reicht das, geht das? Oder kann man den verhärteten Klumpen wieder irgendwie aufweichen?
Das wars erstmal..

Viele Grüße,

Nora

Ronald Schulte

Nora,

Zuerst hast du die fragen vergessen und dann kommen doch wider einige im schreiben auf!! Kommt mir wenig Strukturiert vor!
Was ich davon verstehe sind es alle fragen für Chemiker.
Vielleicht Reagiert da noch eine. Versuche mal deine fragen zuerst zu Überlegen und dann klar zu stellen, dann kann jemand auch begreifen was deine fragen sind.

Grusse Ronald 
Mikroskope:
Leitz Orthoplan (DL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotom:
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

Nora

Naja, wies halt so ist, der Hunger kommt mit dem Essen, und die Fragen kommen mit dem Überdenken was man eigentlich gemacht hat...
Vielleicht sollte ich Montag morgen keine Beiträge schreiben, die wurden schonmal bemängelt. Ich bitte um Entschuldiung. Die Fragen waren auch nicht speziell an Dich gestellt.

Meine Fragen nun konkret:

- Kann Mayersches Hämalaun zu alt für schöne Färbungen sein bzw woran erkenn ich daß die Lösung nicht mehr gut ist?

- Warum soll man Bouinsche Lösung immer frisch ansetzen? Es ist Formol drin, aber warum gibt es dann das Gemisch fertig zu kaufen wenn es nicht einige Zeit haltbar wäre?

- Kann ich zartes Gewebe, das beim Entwässern zu einem harten Klumpen zusammengeschrumpft ist, wieder weich bekommen? Wenn ja, wie?

- Warum klumpt selbiges Gewebe nach Bouin erst in 100% Alkohol, nach Formol und EDTA schon bei nichtmal 70%? EDTA wurde im übrigen gründlich ausgewaschen

- Kann in Formol fixiertes, mit EDTA entkalktes, gründlich mit Wasser gewaschenes Gewebe auch in 50% EtOH bzw Isopropanol gelagert werden?

Das wars, aber die nächsten Fragen kommen bestimmt...
Danke und Grüße,

Nora

JB

Hallo Nora,

Sollen aus den Proben (Hydrozoen?) histologische Schnitte gemacht werden, mikroskopische Totalpraeparate oder Totalpraeparate in Fluessigkeit. Man muesste jeweils unterschiedlich vorgehen.

Fuer Totalpraeparate gibt es nuetzliche Tips in diesem Buch:  Piechocki (2007): Makroskopische Präparationstechnik. Band 1 Wirbellose http://www.schweizerbart.de/publications/detail/artno/181200706

Beste Gruesse, Jon

Nora

Sorry für die verspätete Antwort, hier war ziemlich viel los.
Also Danke für den Tip, ich werd schaun daß ich das Buch auftreibe, was nützliches findet sich sicher darin. :)
Im Prinzip soll alles drei gemacht werden, also aus den größeren Tierchen Schnitte, aus den ganz kleinen Totalpräparate, und dann soll als letztes immer Material "ready to use" dasein, ohne daß man erst lang relaxieren, fixieren, waschen, entwässern muß, wenn jemand spontan einen speziellen Schnitt haben will oder Studentenpraktikum ansteht oä. Also kein "richtiges" Totalpräparat.

Immoment ist es allerdings eh hinfällig, da ich der Laborleitung meine Schwangerschaft mitteilen mußte, und man mir postwendend den Umgang mit JEGLICHEN Chemikalien die auch nur den popligsten H-satz tragen verboten hat, bis evtl ein OK vom Betriebsarzt kommt. Ist zwar sehr vorsorglich, aber ich bin grad ziemlich gefrustet, und hoffe daß Abzug und Schutzkleidung als angemessen akzeptiert werden, hab kein großes Bedürfnis die nächsten Monate nur mit "Dateneingabe" zu verbringen, wo ich hier grad so spannende Versuchsreihen am Laufen hatte.

In diesem Sinne, wer noch Antworten auf die Fragen weiß, trotzdem immer gerne, ansonsten werd ich den Faden in einem Jahr wieder reaktivieren... ;D
Viele Grüße,

Nora

JB

Hallo Nora,

OK. Ich denke, dass Sie nicht alle Cnidarier gleich behandeln koennen. Die Unterschiede zwischen den Gruppen sind betraechtlich, deshalb wird ein Protokol kaum je allen Taxa gerecht werden. Fixierloesungen, die mit einer Art gut funktionieren, fuehren bei anderen zu Schrumpfungen und bei wieder anderen zum Zerfall. Genauso funktionieren Faerbeloesungen bei einigen Arten gut, bei anderen schlechter. Da hilft nur Literatursuche und ausprobieren (das Buch ist ein guter Anfang).


1) Totalpraeparate

- sieht man oft ganz klassisch mit Boraxkarmin; definitiv einen Versuch wert http://www.mikrohamburg.de/HomeHydrozoa_E.html
- uralte Haemalaunloesungen funktioneren auch schon mal nicht; einfach mal neue kaufen, viel kostet es nicht


2) Fixierloesungen

- in der alten Literatur wird Sublimat-Eisessig empfohlen (funktioniert super), das ist aber heutzutage keine Option mehr  ;) https://ia600401.us.archive.org/33/items/handbookofbasicm00gray/handbookofbasicm00gray.pdf
- zur besseren Strukturerhaltung sollte man es mal mit stark vernetzenden Fixiermitteln versuchen, z.B. 10% Formalin in Seewasser oder mit Glutaraldehyd/Formaldehyd Mischung (Church, SH, S Siebert, P Bhattacharyya, CW Dunn (preprint) The Histology of Nanomia bijuga (Hydrozoa: Siphonophora). http://biorxiv.org/content/biorxiv/early/2014/10/29/010868.full.pdf )
- Aufbewahrung in 4% gepuffertem Formaldehyd oder auch (habe ich zum ersten Mal gesehen) Auswaschen mit PBS und Aufbewahrung in PBS + 1ng/ul Natriumazid (= ohne Formaldehyd)
- 50% Ethanol wird selten empfohlen, weil es auf Gewebe mazerrierend wirkt (70% ist besser)


3) Schneiden

Wenn die Tiere beim Entwaessern hoffnungslos verschrumpeln hilft zur besseren Strukturerhaltung das vorherige Einbetten in Agar:
- Fixieren wie normal
- Eingiessen in 1,2% low melting point agarose
- Agarblock mit dem Tier ausschneiden (+ 2 mm an allen Seiten)
- Wie normal durch Alkoholreihe, Isopropanol, Xylol und Paraffin einbetten (die Zeiten entsprechend der Groesse des Agarblocks anpassen)
- Schneiden (das Tier bleibt also im Agar und der Agar wird einfach mit geschnitten)

Viel Erfolg, Jon


Nora

Lieber Jon,

herzlichen Dank für die ausführliche und hilfreiche Antwort!!

Allzu vielfältige Gruppen hab ich aktuell nicht, ein paar ausgewählte Korallen, aber auch die scheinen sich schon beim Relaxiern und Fixieren zB beträchtlich zu unterscheiden (Xenia und Montipora zB)

Hämalaun werd ich dann wohl wirklich frisches besorgen, wie alt es wirklich ist weiß niemand, aber es war wohl schon mindestens ein Jahr offen. Bin gespannt ob die Färbungen dann schöner werden, immoment sehen sie irgendwie... kratzig aus, nicht schön, leuchtend sondern, ja grau, gräulich

Sublimat muß ich jetzt auch nicht haben... Formalin und Bouin waren soweit ICH das beurteilen kann eine schöne Sache. Darin laß ich sie wohl auch erstmal schwimmen, das mit dem PBS und Natriumazid klingt auch interessant, da mach ich mich mal schlau!

Daß 50%Ethanol mazerierend wirkt ist gut zu wissen und könnte einiges erklären... Ich vermute die etwas "aufgelöst" wirkenden Proben die man mir mal brachte waren vermutlich nicht hochkonzentriert genug gelagert. Wieder was gelernt, bzw wieder aufgefrischt, ganz dunkel hab ichs vermutlich schonmal gehört

Und der Agartip ist Klasse, das probier ich auf alle Fälle aus! Die Agarose bleibt während des ganzen Vorgangs drin? Cool, möcht ich am liebsten sofort ausprobieren  ;D KÖNNTE man die Agarose theoretisch nach dem Entwässern auch wieder entfernen? Wenn ja wie? Erwärmen? Rein aus Interesse, neue Methoden spiel ich gern von vorn bis hinten mit allen Varianten durch, nicht daß das dann unbedingt auch sinnvoll ist... 8)

Also, herzlichsten Dank nochmal!!! :D

Nora

JB

Zitat von: Nora in Februar 12, 2015, 15:42:00 NACHMITTAGS
Hämalaun werd ich dann wohl wirklich frisches besorgen, wie alt es wirklich ist weiß niemand, aber es war wohl schon mindestens ein Jahr offen. Bin gespannt ob die Färbungen dann schöner werden, immoment sehen sie irgendwie... kratzig aus, nicht schön, leuchtend sondern, ja grau, gräulich

Und der Agartip ist Klasse, das probier ich auf alle Fälle aus! Die Agarose bleibt während des ganzen Vorgangs drin? Cool, möcht ich am liebsten sofort ausprobieren  ;D KÖNNTE man die Agarose theoretisch nach dem Entwässern auch wieder entfernen? Wenn ja wie? Erwärmen?


Hallo Nora,

1 Jahr altes Haemalaun sollte noch gut funktionieren, daran liegt es vermutlich nicht (ich dachte da an 30 Jahre altes, das man mal wechseln koennte). Ich bevorzuge das sehr robuste Haemalaun nach Harris http://stainsfile.info/StainsFile/stain/hematoxylin/aluminum/harris.htm , allerdings OHNE das Quecksilberoxid (statt dessen Oxidation an der Luft, 4 Wochen, oder mit Wasserstoffperoxid).

Die Agarose bleibt, wo sie ist! Das Endprodukt der Einbettung ist ein kleiner, harter Block von Agar, der voellig von Paraffin ausgefuellt ist, mit den Tieren im Inneren.

Agar ist ein Gel, das nur zu 1,2% aus Agarose besteht. Die restlichen 98,8% sind Poren, die mit Wasser gefuellt sind. In der Einbettung wird das Wasser in den Poren erst durch Alkohol und dann durch Paraffin ersetzt. Der Agar stoert weder beim Entwaessern noch beim Schneiden oder bei der HE Faerbung.

Beste Gruesse, Jon

JB

Zitat von: Safari in Februar 12, 2015, 15:59:40 NACHMITTAGS
Danke für den Link. Wo ist das Problem? Ist Mercuric Chloride inzwischen schlecht zu bekommen?

Hallo Wolfgang,

Der Kauf ist kein Problem, aber die Entsorgung als Sondermuell ist SEHR teuer. Deshalb macht das heute niemand mehr. Dann sind da die Vergiftungsgefahr und die teuren Sicherheitsmassnahmen ... da sich mit Glutaraldehyd/Formaldehyd ebenso gute Ergebnisse bekommen lassen, lohnt sich der Aufwand nicht. Ausserdem bekommtman laestige Quecksilberniederschlaege in den Schnitten, die man erst mit Iod entfernen muss usw. usv.

Beste Gruesse, Jon

Klaus Henkel

Zitat von: Nora in Januar 26, 2015, 09:57:51 VORMITTAG
Liebes Forum,

nachdem ich nun endlich beim Fixieren angekommen bin, tun sich mir verschiedene Fragen auf, wie folgt:

2. Im Romeis 17. auflage steht, daß "auch monatelanges Liegen in der Lösung nicht schädlich ist", in der aktuellen Ausgabe finde ich nichts dazu? In der Wikipedia steht dagegen "Ungetrocknete Gewebe sollten weniger als 24 Stunden in Bouin-Lösung fixiert werden".
Ja was denn nun?

Guten Abend Nora!

Die 16., 17. und 18. Auflage haben jeweils verschiedene Autoren. Die dürften durchaus unterschiedliche Auffassungen zu manchen Details haben.

Zitat3. Ist es besser, die fixierten Gewebe im Kühlschrank in der Fixierlösung (ich habe aktuell 5% Formalin bzw eben Bouin) zu lagern, oder fertig gewaschen in 70% EthOH? Letzteres ist hier im Haus wohl Usus, die Proben die ich allerdings bisher in dieser Form bekam, schienen mir etwas... flusig, wie soll man sagen, nicht mehr wirklich schön, etwas degradiert, in beginnender Auflösung begriffen. Vielleicht wurde auch nicht ausreichend fixiert, das kann ich leider nicht sagen, aber könnte es daran liegen?
Das Lagern ist zum einen notwendig wenn mal mehr Material anfällt bzw andere dringendere Aufgaben, als ich dann frisch abarbeiten kann, und zum anderen soll von manchen Sachen immer was auf Vorrat sein, für Studenten/Praktikum usw. Von dem her neige ich ja zu der Ethanollösung, weils dann eben wirklich ready to use ist, aber wie gesagt, mir scheint das nicht unbedingt dem Erhalt des Gewebes förderlich? Erfahrungen, Tips?
Nora

In einem Ihrer letzten Beiträge hatten Sie ebenfalls von Kühlschrankmaterial geschrieben. Aus der Schilderung gewann ich den Eindruck, daß Sie das Material dann in erwärmtes Paraffin bringen. Sie müssen dann damit rechnen, daß da nichts mehr schmelzen kann, wenn nach Einbringen von Kühlschrankmaterial in das Paraffin, die Temperatur von 55-60 Grad C. auf 35 Grad absinkt. Aber vielleicht habe ich das nur mißverstanden.

Viel Erfolg!
KH