Frage zu Skalenteilen am Feintrieb

Begonnen von chaosquante, November 03, 2008, 18:21:46 NACHMITTAGS

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chaosquante

Hallo,

nachdem ich jetzt mit der Berekschen Formel eine Möglichkeit gefunden habe die Schärfentiefe meiner Objektive zu berechnen würde ich dieses Wissen gerne dazu nutzen die Zahl der Bilder beim z-Stacken zu optimieren. Dazu müsste ich allerdings wissen, welcher Höhenunterschied wie vielen Skalenteilen meines Feintriebs entspricht.

Sind sich dabei alle Hersteller einig? Oder gibt statt eines Skalenteils einen Standard für eine 360° Drehung? Die Zahl der Skalenteile die ca. einer vollen Drehung entsprechen, vagierte auf den drei Mikroskopen die ich mir angesehen habe von 90 über 180 bis zu 360. Irgendwo im Internet hatte ich dann die Information gefunden, dass ein Skalenteil 2 µm sind.

Ein erster Versuch mit einem Deckglass (170 µm, roter Strich oben und grüner Strich unten), ergab bei meinem Axioskop 20 einen Abstand von ca. 96 Skalenteilen zwischen der Scharfstellung bei den beiden Stichen. Das wären ca. 1,8 µm pro Skalenteil. Sind es also tatsächlich 2 µm und ich habe mich um 10% vermessen, oder ist hier jedes Mikroskop anders und man kommt um eigenes Kalibrieren nicht herum?

Grüße chaosquante

Detlef Kramer

Hallo,

ich denke mal, das Deckglas ist nicht genau 0,17 mm dick; das sind sie nämlich nur +/- 0,02 mm, wenn man sie so kauft. Kauft man einfach Deckgläser, sind sie nur 0,15 mm +/- 0,2 mm dick. Warum das so ist , weiß ich nicht, ist aber so. Damit wäre die Abweichung geklärt. Wie es die Mikroskop-Hersteller allgemein halten, weiß ich nicht.

Herzliche Grüße

Detlef Kramer
Dr. Detlef Kramer, gerne per DU

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Rene

The calibration will be dependent on the refraction index of the mountant. You will have to calibrate it with the right mountant. Roughly speaking I expect your coverslip (RI1.5) to be 96*2/1.5 um thick. Hmm. That's quite far of for a #1.5 coverslip?!

HTH, René.

Detlef Kramer

Hallo René,

das Einschlussmittel befindet sich unter dem Deckglas und sollte daher keine Rolle spielen???

Herzliche Grüße

Detlef
Dr. Detlef Kramer, gerne per DU

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chaosquante

Hallo Herr Kramer,

es ist kein #1.5 sondern ein #1 und die sind bei Menzel tatsächlich nur zwischen 0,13 und 0,16 mm dick. Da habe ich wieder etwas dazugelernt, ich dachte Deckgläser wären auf die Objektive abgestimmt und hätten immer 0,17 mm. Also demnächst die #1.5 kaufen. Außerdem hatten sie recht mit mit ihrer Fehlerangabe vom ca. 0,2mm, damit scheiden Objektträger als Kalibrierobjekte wohl aus.

Gibt es irgendwelche Ideen was man sonst noch nehmen könnte? Oder kennt jemand die Herstellerangaben?

Mit freundlichen Grüßen

chaosquante

Detlef Kramer

Hallo,

ich verstehe die Skepsis nicht. Sie haben doch jetzt heraus gefunden, dass die Skalierung am Feintrieb richtig ist. Da es Zeiss ist, würde ich mich darauf verlassen.

D.K.
Dr. Detlef Kramer, gerne per DU

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alemanne

Hallo,
Ihr Verfahren zu Skalenteilen am Feintrieb scheint mir dann Erfolg versprechend zu sein, wenn Sie das Deckglas vorher mit einer guten Mikrometerschraube ausmessen. Falls dann die Gravierung auf dem Feintrieb mit ihrem Messergebnis übereinstimmt, haben Sie auch die Gewähr, dass die Mechanik des Feintriebs noch absolut spielfrei funktioniert.
Herzlichen Gruß,
Helmut Geiser 

Rene

Well, I would never trust things just like that, and I am not even sure if the Z-scale is right within what allowance, and how precise the correction factor corresponds to the refraction index of (in this case) the glass coverslip. I suppose in mountant you could use something round so you can measure the width and calculate the correction factor by taking the depth from the Feintrieb. A centric diatom frustule on it's side will do well.

Mit freundlichen Grüßen,
René.

Frank D.

Hallo chaosquante,

viele Mikroskope haben in ihrer Skalierung eine ganzzahlige Auflösung im µm-Bereich ( 1, 2, 5 ).
Diese Verhältnisse zueinander reichen aus, um den gesamten Verstellbereich einmal mit einem Lineal zu messen
und diesen Wert durch alle Skalenabschnitte zu teilen.
Eine falsch berechnete Höhenteilung von 1µm nach 2µm würde dann bedeuten, sich bei dem gesamten Verfahrweg um das Doppelte vermessen zu haben.

Ansonsten gibt es bestimmt einige Diatomeen, deren Zellwand einen, für diese Größenverhältnisse entsprechenden, Höhenunterschied zeigen.

Mit freundlichen Grüßen
F. Donat

Udo Maerz

Hallo,

ein anderer Vorschlag dazu, falls Forams nicht ohne weiteres verfügbar sind. Das folgende soll jetzt keine Haarspalterei sein.

Ein Haupthaar opfern (sofern noch vorhanden), per Objektmikrometer den Durchmesser bestimmen (unter der Annahme, dass der Querschnitt nahezu kreisförmig ist), und dann denn Tiefenschärfebereich mit dem Feintrieb ausmessen --> Ergebnisse umrechnen und evtl. mit den anderen Ergebnissen vergeichen.

Viele Grüße
Udo Maerz




wilfried48

Hallo an Alle,

Rene hat recht.

Es ist zwar nicht der Brechungsindex des Einschlussmittels sondern der des Deckglases, der berücksichtigt werden muss. Wenn ich mit dem Mikroskop auf die Oberseite und Unterseite des Deckglases fokussiere muss ich mit dem Tisch nicht den geometrischen Weg der Deckglsdicke, sondern die optische Dicke des Deckglases zurücklegen also den geometrischen Weg durch den Brechungsindex teilen. Dann käme die Rechnung von Chaosquante hin und es wären bei einem Deckglas von 150 µm Dicke 96 Skalenteile also ein Skalenteil ca.1,5 µm geteilt durch den Brechungsindex vom Glas von ca. n=1,5 also 1 µm/Skalenteil.
Und das hat das Axioskop auch. Ich habe es eben an unserem Axiophot mit der Messuhr nachgemessen.

Gruss, Wilfried
vorzugsweise per Du

Hobbymikroskope:
Zeiss Axiophot,  AL/DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Axiovert 35, DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Universal Pol,  AL/DL
Zeiss Stemi 2000 C
Nikon Labo-/Optiphot mit CF ELWD Objektiven

Sammlung Zeiss Mikroskope
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=107.0

Elias Horn

Hallo,

generell sollte es so sein:

Differenz von z1 und z2 mit dem Feintrieb ausmessen. Dann die Differenz mit dem Brechungsindex des Spaltes multiplizieren. Dies ergibt die reale Dicke des Spaltes.
Überprüfen kann man das leicht, indem man kleine Deckgläser als Spacer nimmt, einen Spalt erzeugt und diesen einmal mit Wasser und einmal mit Luft misst.

Viel Erfolg!
Elias

chaosquante

Vielen Dank für die Anregungen und die konstruktiven Vorschläge. Ich möchte mal von meinen Erfahrungen berichten.

Den größten Erfolg habe ich mit der ,,rtfm" Methode (read the fu.... manual) erreicht. Da habe ich erfahren, dass eine Umdrehung meines Grobtriebs 2cm Höhenunterschied des Tischs entspricht und, dass der Grobtrieb zum Feintrieb 10:1 untersetzt ist. Außerdem, dass man für orientierende Messungen davon ausgehen kann, dass ein Skalenteil 2µm entspricht.

Meine Skepsis war/ist allerdings durchaus berechtigt. Zeiss spricht selber nur von orientierenden Messungen. Wenn ich meinen Grobtrieb einmal um 360° drehe dreht sich der Feintrieb auch exakt 10-mal mit und der Höhenunterschied entspricht, im Rahmen meiner Messgenauigkeit, auch 2cm. Wenn ich allerdings solange am Feintrieb drehe bis der Grobtrieb einmal herum ist muss ich 11-12-mal drehen. Die Dickenmessungen die mit dem Grobtrieb scharfgestellt wurden passen auch besser als die Werte mit dem Feintrieb. Hier gibt es also einen nicht unerheblichen Schlupf. Ist das eigentlich normal? Vielleicht ist es das Einfachste ein digitales Objektmikrometer so umzubauen, dass es die Tischposition anzeigt. Wieder mal ein interessantes Selbstbauprojekt.

Ich habe noch einmal je zwei Exemplare unterschiedlich dicker Deckgläser mit der Mikrometerschraube nachgemessen und anschließend die Dicke mit dem Mikroskop unter der Annahme 1 Skalenteil = 2µm und Scharfstellung am Grobtrieb nachgemessen. Die erste Sorte hatte eine mit der Mikrometerschraube gemessene Dicke von 145 +/- 2 µm (Das entspricht auch genau der Nenndicke dieses Typs). Der Abstand vom oberen zum unteren Fokuspunkt betrug ca. 80 +/- 1 Skalenteile entsprechend 160 +/- 2 µm. Ein ähnliches Ergebnis habe ich auch mit einem dünneren Deckglas von 70 +/-2 µm bekommen. Der Abstand betrug 38 +/-1 Skalenteil entsprechend 76 +/-2µm. In beiden Fällen also eine Abweichung um ca. 10% nach oben.

Die Idee mit den Haaren ist wirklich kreativ, aber mit meinen Haaren sicher zum Scheitern verurteilt. Ich habe Haare vom kaukasischen Typ habe und die haben einen ovalen Querschnitt. Asiaten hätten es da etwas besser ihre Haare sind ehr rund, afrikanische Haare sind wieder gar nicht geeignet, denn die haben einen fast nierenförmigen Querschnitt. Ich hatte im alten Forum mal einen Querschnitt mit der Autofluoreszenz eines Haars veröffentlicht. Die vom Kreis abweichende Form ist sicher nicht nur auf meine schlechte Schnitttechnik zurückzuführen.

Trotzdem könnte die Idee ganz gut funktionieren wenn man statt des Haares einen Draht nimmt und die mit dem Objektmikrometer kalibrierte Längenmessung der Mikroskopie-Software verwendet. Bei meiner Testmessung mit einem Draht einer Breite von 195 +/- 1µm lagen der scharfe Rand und die scharfe Oberseite 76 Skalenteile auseinander. Da ich damit eigentlich nur den halben Draht vermessen habe sollte der Draht demnach eine Dicke von 304µm haben. Dieser Fehler ist doch erheblich größer als der Fehler mit den Deckgläsern. Evtl. geht es mit einem transparenten Faden besser.

Was mich allerdings immer noch irritiert ist die Sache mit dem Brechungsindex. Das verwendete Glas hat einen Brechnungsindex von ca. 1,525. Wenn ich über das Deckglas mit der Markierung ein weiteres Deckglas lege und den Abstand der beiden Markierungen bestimme bekomme ich auf jeden Fall einen ca. doppelt so große Abweichung nach oben. Der Brechnungsindex spielt also sicher eine Rolle. Aber eigentlich sollte es eine Bildanhebung z der unteren Markierung geben die sich aus der Glasdicke d und dem Brechungsindex n nach z=d-d/n berechnet. Ich müsste also doch damit rechnen, dass ich die Glasdicke um 48µm zu dünn bestimme. Ich messe aber konstant zu viel und mit einem zweiten Deckglas noch mehr zu viel. ???

Mein Fazit ist auf jeden Fall, dass die Positionierungsgenauigkeit an meinem Mikroskop nicht gut genug ist um beim Stacking mit sehr knappen Überlappungen zu arbeiten. Außerdem habe ich den Einfluss des Brechungsindex rechnerisch nicht im Griff. Also werde ich mit einem Sicherheitszuschlag von 50% arbeiten, dann sollten sich die Bilder auf jeden Fall überlappen.

Werner Jülich

Nach meinen Erfahrungen macht man es in der Praxis so, dass man eine genaue Meßuhr mit Datenausgang einsetzt, Mahr liefert solche feinen Dinge. Dann erhalten sie für ein paar hundert Euro eine Z-Auflösung von 1µm, reproduzierbar und direkt im Rechner.
Die Uhren werden wahlweise mit 12,5-25-50 und 100 mm Verfahrweg geliefert.
Die meisten Messprogramme können diese Uhren auslesen.

Werner Jülich

Rene

Hallo Herr Breitzke, I wouldn't be surprised that the correction value of the RI is reached only at small distance measurements. Have you got a low-power oil immersion lens? I expect the Abweichung to be gone there.

Best wishes, Rene.