Autor Thema: Paramecium in Acridinorange Fluoreszenz  (Gelesen 3185 mal)

paramecium

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Paramecium in Acridinorange Fluoreszenz
« am: Oktober 10, 2015, 14:58:37 Nachmittag »
Hallo zusammen,

gerne stelle ich hier eine Aufnahme ein, die die Interpretation der Fluoreszenz von Acridinorange am Beispiel von Paramecium erläutert. Paramecium, das berühmte Pantoffeltier, ist besonders interessant, da man unter anderem an ihm das Mysterium der "Acridin Orange Particles" aufgeklärt hat.

Die Acridinorange (AO) Färbung ergibt gewöhnlich mit DNA – z.B. im Zellkern, bei Ciliaten differenziert in Macronuclei und Micronuclei – einen grün fluoreszierenden Komplex. Kasten (1967) bezeichnet diesen in seiner Arbeit als Complex I. Die Bindung an DNA wird u.a. über Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem AO den DNA Phosphatgruppen (DNA-Polymer) erklärt. Depolymerisierte DNA, wie sie u.a. auch in bestimmten Phasen der Zellteilung vorliegt, führt zu einer leichten Rot-Verschiebung des Farbtons. Sich teilende Zellkerne sind oftmals in einem gelblichen Grundton gefärbt, da sich entlang der getrennt oder aufgewickelt vorliegenden DNA mehr Farbstoffmoleküle an die DNA anlagern können. Es findet eine Eigenfilterung des Farbstoffs statt, bei dem emittiertes Licht von benachbarten AO-Molekülen wieder absorbiert und weggefiltert wird. Damit reduziert sich der Grünanteil der Fluoreszenz aufgrund der Absorption und die Farbe verschiebt sich mit zunehmender Konzentration des Farbstoffs in den Organellen hin zum Roten.

Neben dieser typischen Färbung findet man im Fluoreszenz-Mikroskop bei einigen Organismen und Zelltypen überraschend kleine, rot gefärbte Organellen. Diese wurden in den 1960ern unter dem Begriff "Acridinorange Partikel" in der Literatur diskutiert. Man versuchte verschiedene Erklärungsversuche der Rotfärbung. Auch die Annahme, dass diese rote Färbung mit einem Laborbefund korreliert, nämlich der roten Fluoreszenz die man bei isolierter RNA beobachtete. So wurden die roten Teile der Zellen u.a. auch als mitochondriale RNA interpretiert. Andere Thesen gingen von einer Ausfällung des Farbstoffs aus oder von einer Reaktion auf Verletzung.

Bei Paramecium und an HeLa Zellen (menschliche Krebszellen) wurde diese Färbung schließlich auf andere Weise geklärt, nämlich eine vom pH Wert abhängige (höhere Konzentration?) Emission des kationischen Farbstoffmoleküls in sauren Organellen. Die in Paramecium gefundenen Organellen erhielten sogar einen eigenen Namen. Allen & Fok (1983) nannte die neu entdeckten Organellen Acidosome.

Mit einigem Geschick kann man lebende Paramecium Individuen in AO Färbung längere Zeit beobachten. Dabei klemmt man sie unter dem Deckglas und ersetzt während der Beobachtung gelegentlich verdunstendes Wasser vorsichtig, so dass die Zellen nicht gleich fortschwimmen können. Bei längerer Beobachtung wird der Farbstoff allmählich ausbleichen, so dass der Zellkern nach einer Weile nicht mehr gefärbt erscheint. Die übrigen Organellen speichern jedoch größere Konzentrationen des Farbstoffs, der hier offenbar auch nicht so schnell oxidativ abgebaut wird.

Die Abbildung zeigt eine typische Färbung von Parameciumzellen. Deutlich sichtbar sind im hinteren Teil der Zelle häufiger vorkommende kleine (punktförmige) Organellen, die einen deutlichen Rotton haben. Es handelt sich hier um die Acidosome, welche an der Bildung der Phagosome (Nahrungsvakuolen) beteiligt sind. Im rechten Teil der Aufnahme habe ich die einzelnen Bereiche der Zelle markiert, die hier zu sehen sind. Unterhalb des Zellmunds bildet sich gerade ein neues Phagosom. Blasenförmig lagern sich die Acidosome hier am Ende des Zellmunds an. Das Phagosom wird später abgeschnürt und wandert während der Verdauung anfänglich rot, später gelb und am Ende nahezu grün durch das Zellplasma. Die Veränderung der Farbe ist auf die Veränderung des pH Werts während der Verdauung zurückzuführen, wobei der pH Wert der Vakuole im Laufe der Zeit immer weniger sauer erscheint (grün). In vielen anderen Ciliaten übernehmen Lysosome diese Funktion. Bei Paramecium scheint man hier noch zwischen Acidosomen und Lysosomen differenzieren zu müssen.

Legende:

Ma:   Macronucleus, hier entfärbt durch Photobleaching

O:    Zellmund

pV:   pulsierende Vakuole

Ac:   Acidosome

Ph:   Phagosom (Nahrungsvakuole)

Ph*: sich bildendes Phagosom


Literatur:


Allen R. D., Fok, A. K. Nonlysosomal Vesicles (Acidosomes) Are Involved in Phagosome Acidification in Paramecium. Journal of Cell Biology. 1983; 97: 566-570.

Bauer, T., 2015. Interpretation der Acridinorange Färbung von Ciliaten (Ciliophora) des Süßwassers und des Bodens. Mikroskopie, Nr. 1, 2015, Editor: J. Piper. Dustri Verlag, Dr. Karl Feistle, ISSN 2197-4543. DOI 10.5414/MKX0058

Kasten F. H. Cytochemical Studies with Acridine Orange and the Influence of Dye Contaminants in the Staining of Nucleic Acid. In: Bourne, G. H., Danielli, J. F. International Review of Cytology Vol. 21. New York, London: Academic Press; 1967, p. 141-202.

« Letzte Änderung: Oktober 10, 2015, 19:59:03 Nachmittag von paramecium »

Eckhard

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Re: Paramecium in Acridinorange Fluoreszenz
« Antwort #1 am: Oktober 10, 2015, 20:58:25 Nachmittag »
Hallo Thilo,

danke für das Beispiel. Die Färbung der Acidosome und der Nahrungsvakuolen durch AO war mir unbekannt. Allerdings bin ich verwundert, dass weder Makro- noch Mikronukleus angefärbt sind. Hast Du eine Erklärung dafür?

Herzliche Grüsse,
Eckhard
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