LSM, ein paar spezielle Fragen

[Johannes Kropiunig]

Hallo,

in letzter Zeit beschäftige ich mich mit LSM und hätte dazu ein paar Fragen, die da wären.

1. Wie wird die Rasterweite in Vergrößerung umgerechnet?
2. Welches Objektiv für welche Rasterweite?
3. Welche Größe des Pinholes vor dem Detektor für welches Objektiv (möglichst in µm) und wie werden diese Pinhols üblicherweise hergestellt?
4. Wie muss man sich ein verstellbares Pinhole vorstellen von dem ich gelesen habe, durch einen Wechsler, oder ist es tatsächlich in seiner Größe variabel?  
5. Muss bei einer 3D-Rekonstruktion auf den Brechungsindex des Deckglases und des Einbettmediums Rücksicht genommen werden und wenn ja, wie?
6. Gibt es Lookup Tabellen mit denen sich eine 12 Bit, oder höhere Helligkeitsauflösung farblich darstellen lassen ?  

Ich hoffe das sind nicht allzu dämliche Fragen und würde mich, falls überhaupt möglich, über leicht verständliche Antworten freuen.

Viele Grüße,
Johannes  

[JB]

Ich gehe aufgrund der Fragen mal davon aus, dass mit "LSM" confocal laser scanning microscopy und nicht light sheet microscopy 

4. Wie muss man sich ein verstellbares Pinhole vorstellen von dem ich gelesen habe, durch einen Wechsler, oder ist es tatsächlich in seiner Größe variabel?  

Beides ist moeglich und wird verwendet (links und in der Mitte) http://allmicroscope.com/wp-content/uploads/2015/05/Confocal-Microscope-Scanning-Unit-examples.jpg

[Klaus Henkel]

Ich gehe aufgrund der Fragen mal davon aus, dass mit "LSM" confocal laser scanning microscopy und nicht light sheet microscopy  

Beide Begriffe gibt es. Light Sheet M. besteht aus einem feinen "hauchdünnen" Lichtbüschel, das auf ein Objekt gerichtet wird,  und dieses wird in einem Behältnis oder einer dünnen Röhre um seine eigene Achse gedreht. Sind auf diese Weise 360° fotografiert, folgt die nächste Ebene, usw. Danach kann man das Objekt, wenn die Ebenen "zusammengerechnet" sind, rundum betrachten, alle 360°! Man braucht dazu sehr schnelle und speicherreiche Rechner. Die Light Sheet M. wird auch gelegentlich mit Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) bezeichnet.
Mit Confocal und Laser hat das eigentlich nichts zu tun.

Im März 2013 war ich auf dem 13. Tag der Mikroskopie bei Zeiss in Jena, wo der Prototyp mit begeisternden Videoaufnahmen vorgeführt wurde.

Gruß
KH

[Johannes Kropiunig]

Hallo,

richtig, mit LSM ist die konfokale Laser Scanning Mikroskopie gemeint, danke für deine Antwort.

Wenn es nun auch variable Pinholes gibt, würde mich mal interessieren wie diese Dinger funktionieren. Sind dies einfach 2 verstellbare Schlitzblenden welche zueinander um 90° gedreht montiert sind? Eine Irisblende mit einer so kleinen Öffnung kann ich mir beim besten Willen nicht vorstellen, eher noch eine Membran mit Loch, wobei sich dieses Loch durch Auseinanderziehen vergrößern lässt und umgekehrt.

Viele Grüße,
Johannes  

[JB]

Hallo Johannes,

Das Pinhole befindet sich im Bildraum, damit muss es auch nicht so furchtbar klein sein (Mikrometerbereich). Im einfachsten Fall sind es 2 L-foermige Blendenlamellen, die gegeneinander bewegt werden (quadratisches Pinhole). Sechseckige gibt es aber auch. Man kann die Blenden aber auch im Millimeterbereich bauen: https://books.google.co.uk/books?id=Y0YyBwAAQBAJ&pg=PT140&lpg=PT140&dq=confocal+microscope+physical+pinhole+size&source=bl&ots=goqkSee2Qg&sig=mPbhErSa1KephtxOgsXOATRDM1M&hl=en&sa=X&ved=0CDgQ6AEwBGoVChMI0_Xf583byAIVCckUCh2WIgCo#v=onepage&q=confocal%20microscope%20physical%20pinhole%20size&f=false

Fuer jedes Problem haben sich die Firmen etwas einfallen lassen. Die meisten Nutzer werden Ihnen zu Ihren Fragen eigentlich nur sagen koennen: "Das stellen Sie in der Software ein."  

Wenn es Sie wirklich interessiert, dann sollten Sie sich in die Spezialliteratur einlesen. Die gibt es in Dt. problemlos in jeder Kreisbibliothek per Fernleihe: http://www.olympusconfocal.com/books/

Beste Gruesse,

Jon

[Johannes Kropiunig]

Hallo Jon,

nachdem ich mir so ein kleines stage scanning LSM selbst gebaut habe, muss es mich interessieren um das Maximum daraus holen zu können. Mit den Rasterweiten von ~0.2µm über alle 3 Achsen bin ich schon ganz zufrieden, aber eben dieses Pinhole macht mir ein wenig zu schaffen. Ein Wechsel und damit verbundener Neujustage ist nicht gerade komfortable und ein in der Größe verstellbares wäre ideal. So wie es aussieht liegen diese Systeme jedoch nicht in dem Bereich des für mich finanziell leistbaren und lasse mir wohl was eigenes einfallen. Punkt 4 ist damit für mich erledigt und würde mich freuen, falls du bzw. jemand anderes mir auch bei den anderen Punkten weiterhelfen könnten.

Viele Grüße,
Johannes

[d65]

Hallo Johannes,

folgende Antworten aus Anwendersicht:

1. Wie wird die Rasterweite in Vergrößerung umgerechnet?
Eigentlich gar nicht. Vergrößerung auf welches Format den? Das Bild am Monitor lässt sich beliebig Zoomen. Wenn ich es mit dem Beamer an die Wand werfe kann ich millionenfach vergrößern. Die einzig sinnvollen Angaben sind daher die Formatgröße (also z.B. 20x20 µm) oder die "Pixelgröße" womit eigentlich der Abstand vom Mittelpunkt eines Pixels zum Mittelpunkt des nächsten gemeint ist. Um die richtig zu berechnen muss der Computer, der das Bild erstellt 'wissen' wann der Laserstrahl gerade wo abrastert. Das lässt sich ja mit Testpräparaten rausfinden.

2. Welches Objektiv für welche Rasterweite?
Was meinst Du mit Rasterweite? Pixelabstand oder Bildkantenlänge? Generell kommt es drauf an was wichtiger ist, gute Übersicht (also geringe Vergrößerung) oder hohe Auflösung (also hohe NA und damit tendenziell hohe Vergrößerung). Wenn jemand die maximale Auflösung rausholen will empfehle ich eine 'Pixelgröße' (s.o) von 1/3 des Rayleigh-Kriteriums.

3. Welche Größe des Pinholes vor dem Detektor für welches Objektiv (möglichst in µm) und wie werden diese Pinhols üblicherweise hergestellt?
Das Pinhole befindet sich in der Zwischenbildebene. Eine Standardgröße ist 1 Airy-Unit, also der Durchmesser des Beugungsscheibchens. Wie viel das in µm ist hängt von der NA des Objektivs und von der Vergrößerung ab. Und natürlich von der Wellenlänge.

4. Wie muss man sich ein verstellbares Pinhole vorstellen von dem ich gelesen habe, durch einen Wechsler, oder ist es tatsächlich in seiner Größe variabel?
Das erste erfolgreiche kommerzielle Confocal, das BioRad 500, hatte tatsächlich eine gewöhnliche Irisblende. Der Strahlengang war über einen Meter lang um das zu ermöglichen. Das Leica Science Lab hat einen Artikel, wie sie das heute angehen:
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/pinhole-geometry-four-corners-are-perfect/

 
5. Muss bei einer 3D-Rekonstruktion auf den Brechungsindex des Deckglases und des Einbettmediums Rücksicht genommen werden und wenn ja, wie?
Na ja, wenn es zur Rekonstruktion kommt ist es zu spät. Schon bei der Aufnahme ist der Ri des Einbettmediums wichtig, sonst gibt es sphärische Aberrationen, die zu Auflösungs- und auch Helligkeitsverlusten führen. Die Deckgläser sollten 170 µm dick sein, dafür sind die Objektive gerechnet. Dann sollte es keine Probleme damit geben.
Das einzige, was man bei der Rekonstruktion noch berücksichtigen kann ist die falsche Fokustiefe. Wenn ich mich recht entsinne ist die Abweichung für wässrige Präparate mit einem Olimmersionsobjektiv etwa 20 %, das heißt die Mechanik fährt 8 µm vom Deckglas ins Wasser hinein, auf Grund der Ri-Abweichung ist der tatsächliche Fokuspunkt aber 10 µm weit vom Deckglas entfernt. Ich bin mir was die Zahlenwerte angeht aber nicht mehr ganz sicher.


6. Gibt es Lookup Tabellen mit denen sich eine 12 Bit, oder höhere Helligkeitsauflösung farblich darstellen lassen ?  
Da Monitore in der Regel nur 256 Helligkeitsstufen darstellen können und das menschliche Auge noch weniger hinbekommt ist das eigentlich nicht nötig. Man kann sich damit behelfen, dass man nur den dynamischen Bereich darstellt, also wenn zum Beispiel das dunkelste Pixel 300 und das hellste 1000 hat, dass dann 300 schwarz ist und 1000 weiß.
Ob es überhaupt Sinn mach mehr als 256 Graustufen zuzuordnen steht auf einem anderen Blatt, denn zumindest bei hohen Auflösungen (Ölimmerison) wird man wenn man an der Auflösungsgrenze arbeitet selten mehr als 50 Photonen pro Pixel einfangen, jedenfalls bei Immuno-Fluoreszenzpräparaten. Das wird für konfokale Reflexions- oder Durchlichtbilder natürlich anders sein.

Was die Abkürzung betrifft, da bietet sich clsm zur Unterscheidung an. Zumal die ersten Laserscanningmikroskope von Zeiss (LSM) noch nicht konfokal waren, also mit lsm auch noch gemeint sein könnten.

nachdem ich mir so ein kleines stage scanning LSM selbst gebaut habe, ...

Das ist beeindruckend! Vielleicht magst Du bei Gelegenheit mal ein Foto des Aufbaus posten.

Gruß

Steffen

[Johannes Kropiunig]

Hallo Steffen,

vielen herzlichen Dank für deine umfangreiche Antwort!!

Punkt 1. So etwas habe ich mir schon gedacht, allerdings sieht man auch bei REM-Aufnahmen immer wieder Vergrößerungsangaben.

Punkt 2. Ich meinte den Rasterabstand, da hatte ich mich verschrieben. 1/3 des Rayleigh-Kriteriums also. Okay, da steht nach Programmieren, Elektronik und Mechanik als nächstes theoretische optische Physik auf meinen Lehrplan. 

Punkt 3. Siehe Oben.

Punkt 4. Bei meinen System wird die Form des Pinholes wohl nicht das ausschlaggebendste Kriterium sein. Es ist aber schon interessant zu sehen bis ins welche Detail da geforscht wird.

Punkt 5. Vermesse ich anhand der Reflexion auf der Ober und Unterseite ein Deckglas, liegt diese Messung ohne Berücksichtigung des Brechungsindex von seiner tatsächlichen Dicke weit daneben. Ist nun ein Präparat mit wiederum einen anderen Brechungsindex als das Glas eingedeckt, müsste doch auch das einen zusätzlichen Einfluss auf die scheinbare Dicke des Objekts haben, welche bei der Rekonstruktion berücksichtigt werden sollte. Sehe ich da etwas falsch?

Punkt 6. Richtig, die meisten Monitore können nur 256 Helligkeitswerte darstellen und die Umrechnung von 4092 von diesen auf 256 schmerzt mich jedes mal. Nun kann aber ein trainiertes Auge 500000 Farbnuancen erkennen und ein normaler Monitor über 16 Millionen Farben darstellen. Farblich codiert, sollte eine Darstellung der 12 Bit Helligkeitswerte demnach eigentlich ein Klacks sein und nach genau so einem Farbverlauf würde ich suchen. Da würde es auch ein einfaches Bild tun, ähnlich diesem da.

Quelle: http://rapid-i.com/wiki/index.php?title=File:Lut_pre_fire.png
Nur eben mit 4092 Farbnuancen.

Der Aufbau des Statives ist eigentlich recht simpel und entspricht mit Sicherheit nicht den Vorstellungen die du hast. 3 Achsen werden mit simplen 4mm Gewindestange (Steigung 0,7mm) mithilfe von Schrittmotoren in 1/3200 Schritten bewegt, also ~0.22µm/Schritt. Der Tubus selbst ist noch einfacher gestrickt. Ein 405nm Diodenlaser wird mithilfe eines normalen Strahlenteilerprisma in Richtung Objektiv gelenkt und dadurch auf das Präparat fokussiert.  In der Zwischenbildebene sitzt eben ein Pinhole und danach eine simple Photodiode um die Helligkeit zu messen. Damit die Spiegelungen des Laser im Strahlenteiler nicht stören, wird der Strahl einfach durch eine Blende ringförmig geformt. In der Zwischenbildebene ist also ein Lichtring und in dessen Zentrum der fokussierte Strahl zu sehen und auch nur dieser Lichtpunkt gelangt zur Photodiode, da der Rest vom Pinhole ausgeblendet wird. Diese Form des Strahles hat auch noch den Vorteil, dass kein Licht senkrecht auf das Präparat fällt und somit die Auflösung in Z erhöht wird,trotz des primitiven Aufbaus und noch nahezu gigantischen Pinhole. Nun könnte es natürlich einige geben, habe ich erwähnt, dass das Stativ und er Tubus, bis auf die Linearwellen usw., aus Sperrholz besteht?, die bezweifeln ein solches System tauge etwas. Ich hingegen bin recht einfach zufrieden zustellen und begnüge mich auch schon mit Laserscanns wie diesem hier.

Wafer in Auflickt-Dik und mit eingefügten Laserscan
   
Rasterabstand 0.22µm, Objektiv Achromat100/1.25 Öl

Viele Grüße,
Johannes

[d65]

Punkt 2. Ich meinte den Rasterabstand, da hatte ich mich verschrieben. 1/3 des Rayleigh-Kriteriums also. Okay, da steht nach Programmieren, Elektronik und Mechanik als nächstes theoretische optische Physik auf meinen Lehrplan. 

Vielleicht hilft das weiter, auch weiter unten, Nyquist-Kriterium.

Punkt 5. Vermesse ich anhand der Reflexion auf der Ober und Unterseite ein Deckglas, liegt diese Messung ohne Berücksichtigung des Brechungsindex von seiner tatsächlichen Dicke weit daneben. Ist nun ein Präparat mit wiederum einen anderen Brechungsindex als das Glas eingedeckt, müsste doch auch das einen zusätzlichen Einfluss auf die scheinbare Dicke des Objekts haben, welche bei der Rekonstruktion berücksichtigt werden sollte. Sehe ich da etwas falsch?

Stimmt schon. Wie gesagt, wenn eine Probe in Wasser statt in Öl eingebettet ist gibt es auch eine falsche Tiefe. Ich habe gerade noch mal nachgeschaut, was wir seinerzeit genommen haben, in diesem Fall ist der Faktor  0.82 (und nicht was ich oben angegeben habe). Die Deckglasdicke und Ri des Mediums müssen das sein, was der Hersteller vorgesehen hat, sonst stimmt die Fokusebene nicht mit dem verfahrenen z-Weg überein.

Die passende Literatur dazu ist: Hell SW, Stelzer EHK (1995) Lens aberations in confocal fluorescence microscopy. In: Pawley JB (ed) Handbook of biological confocal microscopy. Plenum, New York, pp 347–354. Es gibt glaube ich auch einen Zeitschriftenartikel von den beiden, da habe ich aber das Zitat nicht.

Der Aufbau des Statives ist eigentlich recht simpel und entspricht mit Sicherheit nicht den Vorstellungen die du hast.

Ach wo, ich hatte gar keine Vorstellung. Aber ich finde es großartig wenn sich jemand die Mühe macht ein funktionierendes Mikroskop oder Konfokalmikroskop aus Einzelteilen zusammen zu bauen. Mir fehlt da leider die handwerkliche Begabung. Das hält mich aber nicht davon ab die Werke anderer zu bewundern.

Klar ist mir der optische Aufbau noch nicht: Der Anregungstrahl wird durch das Objektiv geleitet, also Auflicht/Reflektion, richtig? Meinst Du mit Strahlenteilerprisma so ein Ding? Wo wird der (Anregungs?)-Strahl ringförmig?

Egger und Davidovits haben das Problem mit den Reflektionen 1969 übrigens mit Pol-Filtern gelöst, vielleicht ist das auch eine Option, siehe hier

Gruß

Steffen

[Johannes Kropiunig]

Hallo Steffen,

um Klarheit zu schaffen und deiner Vorstellung ein Bild zu geben wie mein System beschaffen ist, habe ich ein paar Bilder auf Photobucket zusammengestellt. Darunter ist auch ein von Wikipedia entliehener Strahlengang mit eingezeichneter Position dieser erwähnter Blende und der ganz gewöhnliche Strahlenteiler ist auch auf 2 Bildern zu sehen.
http://s1116.photobucket.com/user/Googol1972/slideshow/Blue%20Eye
Mit Polfiltern hatte ich es anfangs probiert, so ist es mir derzeit aber lieber.

Hier noch ein paar alte altes Videos, wobei die Schrittweite inzwischen nochmals halbiert und auch so einiges noch verbessert wurde
https://www.youtube.com/watch?v=GSIikx7NSN4
https://www.youtube.com/watch?v=1S5gDwAaHH8
https://www.youtube.com/watch?v=1yIFSM3at8E
https://www.youtube.com/watch?v=dC6WHi95ueE

Einen ausführlichen Bericht werde ich eines Tages hier präsentieren, versprochen.

Vielen Dank für deine Hilfe,
Johannes

[d65]

Die Welt ist klein, das konfokale Wikipedia-Bild ist von mir 

Wenn ich das Prinzip Deines Strahlengangs richtig verstehe, dann ist der vom Ansatz her eine Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung so ähnlich wie hier:
, aber eben mit fokussieren der Anregung auf einen Punkt (statt Ausleuchtung des Feldes) und confocaler Detektion.

Spannend. Den Aufbau finde ich von außen auf jeden Fall recht gelungen. Ich kann den Lichtweg anhand der Fotos noch nicht nachvollziehen, ich freue mich also auf den Bericht 

[Johannes Kropiunig]

Hallo Steffen,

ich hoffe die Verwendung des Bildes ist erlaubt, anderenfalls entferne ich es natürlich sofort von Photobucket.

Der Strahlengang ist schon so ähnlich wie bei der Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung, nur fällt das Licht direkt durch das Objektiv, und nicht außen herum um dann von einem Spiegelsystem umgelenkt zu werden. Wäre es ein normales Durchlichtmikroskop, entspreche es wohl am ehesten eine ringförmige Beleuchtung,  nur ist hier Objektiv gleich dem Kondensor. Dadurch wird aus dem Brennpunkt des Laser auf ein im Fokus befindlichen Objekt sehr schnell ein Lichtring ober und unterhalb von diesem mit dem Messpunkt in der Mitte.

Mir ist natürlich klar, dass mein System nicht mit dem was du gewohnt bist mithalten kann. Trotzdem, mir macht die Beschäftigung mit meinem < 400€ LSM mächtig Spaß und daher bedanke ich mich nochmals bei dir für deine ausführlichen und hilfreichen Antworten.

Viele Grüße,
Johannes

[d65]

ich hoffe die Verwendung des Bildes ist erlaubt, anderenfalls entferne ich es natürlich sofort von Photobucket.

Kein Problem, 'des passt scho', wie die Leute hier sagen. Unter der Lizenz, unter der ich es ins Netz gestellt habe, müsste bei Verwendung der Name des Urhebers erwähnt werden. Dabei ging es mir vor allem um eine mögliche Verwendung im professionellen Bereich.

Mir ist natürlich klar, dass mein System nicht mit dem was du gewohnt bist mithalten kann. Trotzdem, mir macht die Beschäftigung mit meinem < 400€ LSM mächtig Spaß und daher bedanke ich mich nochmals bei dir für deine ausführlichen und hilfreichen Antworten.

Keine unnötige Bescheidenheit, bitte. Ich finde den Selbstbau ganz prima. Es geht ja nicht darum mit kommerziellen Geräten, die das tausendfache kosten, zu konkurrieren, sondern um den Spaß an der Sache. Wenn man dabei dann auch noch ein wichtiges optisches Prinzip mit vergleichsweise einfachen Mitteln darstellen kann, um so besser.

Gruß
Steffen