Autor Thema: Botanik: Erster Versuch: Thymian *  (Gelesen 8100 mal)

Erich T.

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Botanik: Erster Versuch: Thymian *
« am: Januar 03, 2016, 13:02:36 Nachmittag »
Liebe Kollegen, nach großartiger Hilfe aus dem Forum zur Komplettierung meines Mikroskops, sowie der Versorgung mit Material und Infos zur Färbung botanischer Präparate, möchte ich mein erstes Ergebnis präsentieren. Mir ist klar, dass noch Luft nach oben ist, deshalb bitte ich um kritische Beurteilung und um Tipps zur Verbesserung.

Als erstes Präparat wählte ich Thymian vulgaris. Eine Gewürzpflanze, die in der weihnachtlichen Küche vorrätig war. Alle Schnitte wurden fixiert in AFE, geschnitten mit einem Handmikrotom. Untersucht mit Zeiss Phomi III, Fotos mit Nikon D90. Einbettung in Euparal.

Bild 1:
Stängel quer, Etzold Färbung, Zeiss Planapo 4x/0,14




Bild2:
Detail von Bild1, Neofluar 16x/o,4




Bild3:
Das selbe Präparat als Vergleich mit Wacker sim lt Protokoll, Zeiss Planapo 4x/0,14




Bild 4:
Detail aus Bild 3, Neofluar 16/0,4




Bild 5:
Blatt quer, Wacker sim. lt. Protokoll, Planapo 4x/0,14




Bild 6:
Blattoberfläche von Bild 5, Plan 25x/0,45



Es geht mir wirklich darum meine Arbeit zu verbessern, also haltet euch nicht mit Kritik zurück.
Aus meiner Sicht verbesserungswürdig ist die Anfertigung der Schnitte (zu unregelmäßig), das Einbetten (nicht immer plan). Aber auch das Färben und das Anfertigen der Fotos muß noch verbessert werden. Übrigens, die Belichtungszeit ist 1 min, die Fotos sing gestackt mit Picolay.

Herzlichen Dank an Fahrenheit für die wertvollen Hinweise zur Beschriftung der Fotos.

liebe Grüße
Erich
« Letzte Änderung: Januar 14, 2016, 15:14:18 Nachmittag von Erich T. »

Erich T.

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #1 am: Januar 03, 2016, 13:05:35 Nachmittag »
Also leider ist beim ersten Foto etwas schief gegangen, daher reiche ich es hier nach:

Biuld1: Stängel quer, Etzold


Liebe Grüße
Erich

Klaus Herrmann

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #2 am: Januar 03, 2016, 13:21:10 Nachmittag »
Gratuliere Erich,

die Schnitte sind dir sehr gut gelungen. Das Blatt ist nicht einfach zu schneiden ohne Ausrisse.

 Die Etzoldfärbung gefällt mir auch sehr gut. Bei der ASim fehlt mir irgendwie die blaue Komponente.
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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Klaus Henkel

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #3 am: Januar 03, 2016, 13:57:55 Nachmittag »
Gratuliere Erich,

Bei der ASim fehlt mir irgendwie die blaue Komponente.

Lieber Klaus, liebe Alle!

Könnt Ihr nicht endlich mal aufhören, mit diesen verdammten Insider-Abkürzungen?
Was zum Teutates ist ASim?

KH

Klaus Herrmann

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #4 am: Januar 03, 2016, 15:11:57 Nachmittag »
Lieber Klaus,

 zugegeben schrecklich, aber so ganz ohne geht es auch nicht, sonst hat der NSA nix zum Rätseln!

Robin Wacker hat dereinst eine geniale Färbung entwickelt, die er lange geheim gehalten hat, bis ihm angedroht wurde ihn unter Qualen vom Leben ins Jenseits zu befördrn, dann hat er im MK ;D Rezeptur und Vorschrift veröffentlicht. Und damit fing die Misere an. Der Jörg Weiß  und andere Verbrecher haben in der Rezeptur rücksichtslos rumgepanscht. Nachzulesen auf der wunderbaren Homepage der Bonner. Robin hat seine Ursuppe WA 3 genannt. Bei Jörg steht Sim für simultan: fauler Hund der er ist, hat er die Komponenten zusammen gekippt und dann hat er noch Astrablau gegen Alcianblau ersetzt. Das II steht für die Variante 2 dieser unsäglichen Panscherei.

Na ja: die Färbeergebnisse sind eigentlch ganz schön - muss man schon anerkennen! ;)

Zu meiner Entschuldigung kann ich nur anmerken, dass die Fläschle in denen ich die ASim abfülle zu klein sind um Labels aufzunehmen auf denen steht, dass das die Variante II der Panscherei von Jörg W. ist, die basiert auf der Originalrezeptur WA 3 von R.W. veröffentlicht im MK 2006 Heft 4  8) Eventuell stimmt die Literaturangabe nicht. Ich erinnere mich nur schwach!
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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Wutsdorff Peter

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #5 am: Januar 03, 2016, 18:03:09 Nachmittag »
Hallo Erich,
Gratulation! Ich bin auch ein Anfänger, aber aus meiner Sicht bist Du schon ein Könner.
Ich komme bei Weitem nicht an Deine Ergebnisse heran :(

               Gruß Peter aus Lorsch

Rawfoto

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #6 am: Januar 03, 2016, 18:13:00 Nachmittag »
Hallo Erich

Gratulation, fuer mich sieht das nicht nach den Anfaengen aus.-)

Liebe Gruesse

Gerhard
Gerhard
http://www.naturfoto-zimmert.at

Rückmeldung sind willkommen, ich bin jederzeit an Weiterentwicklung interessiert, Vorschläge zur Verbesserungen und Varianten meiner eingestellten Bilder sind daher keinerlei Problem für mich ...

Erich T.

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #7 am: Januar 03, 2016, 20:22:07 Nachmittag »
Danke für die Rückmeldungen, besonders der Hinweis auf das fehlende Blau in der Wacker Färbung beschäftigt mich. Ich finde auch, dass es im Vergleich zu den anderen Bildern im Forum nicht ausreichend rauskommt. Werde bei Gelegenheit weitere Versuche mit Verdünnung, Zeit, Temperatur, etc. machen.

Fahrenheit

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #8 am: Januar 04, 2016, 10:45:58 Vormittag »
Allen ein gutes neues Jahr!  :)

Lieber Erich,

an Deine Schnitten ist nichts auszusetzen, zumal die verholzten Thymian-"Stämmchen" oft nicht so ganz leicht zu schneiden sind. Auch das Blatt ist klasse geworden. Es gehört schon eine riesen Portion Glück dazu, die Ölidioblasten auf der Blattoberseite heil durch die Präparationskette zu bekommen. :)

Nun zum W3Asim (MKB) oder Asim (Klaus)  ;D

Zunächst muss ich ein paar Lorbeeren weiter reichen: W3Asim I & II ist eine Entwicklung von Rolf-Dieter Müller, der die Mischung mit viel Mühe ausbaldovert hat. Die Bequemlichkeit geht dabei mit einem recht geringen Qualitätsverlust im Vergleich zu Robin Wackers Original-Färbung einher. W3Asim I hat dabei eher einen bläulichen Grundton, W3Asim II tendiert ins Grüne. Asim geht auch eher ins Blau.

Um hier helfen zu können, stelle bitte das genaue Protokoll Deiner Präparation von der Probenahme bis zum Eindecken ein. Ich habe den Thymian im letzten Jahr selbst geschnitten und vielleicht fällt mir was auf.

Was immer wieder vorkommt, ist die rotbraune Färbung der Chloroplasten im Palisadenparenchym der Blätter. "Klassisch" gehört das da nicht hin und kann durch vorsichtiges Bleichen mit Eau de Javelle oder Klorix (blaue Flasche, 1:4 mit Aqua dest.) verringert oder vermieden werden. Andererseits: ich finde es sehr schön, wenn sich die Chloroplasten auch im Dauerpräparat noch abzeichnen, die Kunst ist es, so weit zu differenzieren, dass die Parenchyme nicht überfärbt sind (was mir nicht immer ganz gelingt  ;D )

Hier noch drei Links auf die Webseite des MKB rund um die verwendeten Färbungen und zum Thymianblatt:
Beschreibung W3Asim Familie: http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanische_mikrotechnik/index.html#a754
Vergleich W3Asim & Asim: http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanische_mikrotechnik/index.html#a3281
Thymianblatt W3Asim II: http://www.mikroskopie-bonn.de/themengalerie/botanische_schnitte/index.html#a4042

Herzliche Grüße
Jörg

p.s.
Ich habe Deinen beitrag gelistet. :)
« Letzte Änderung: Januar 05, 2016, 13:35:57 Nachmittag von Fahrenheit »
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Bernhard Lebeda

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Re: Erster Versuch: Thymian
« Antwort #9 am: Januar 04, 2016, 12:26:23 Nachmittag »


Um hier helfen zu können, stelle bitte das genaue Protokoll Deiner Präparation von der Probenahme bis zum Eindecken ein.


...und vielleicht könnten wir um Verwirrungen zu vermeiden noch mal auf den Unterschied zwischen "Eindecken" und "Einbetten" hinweisen. Letzteres ist das montieren des Schneidguts VOR dem Schnitt (z.B in Paraffin o.ä.), ersteres der Vorgang NACH dem ganzen Prozedere zur Verarbeitung zum Dauerpräparat!

Dessen ungeachtet gefällt mir die ganze Arbeit sehr, sehr gut, für ein Erstlingswerk geradezu genial!

Fototechnisch vielleicht das eine oder andere etwas überbelichtet und die eine oder andere Vignettierung vergessen zu entfernen.

Summa summarum: große Klasse!!


Viele Mikrogrüße

Bernhard
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Vorstellung

Wutsdorff Peter

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Re: Botanik: Erster Versuch: Thymian *
« Antwort #10 am: Januar 04, 2016, 18:55:38 Nachmittag »
Guten Abend Erich,
ich schließe mich dem Wunsch von Jörg an, mit  der bitte um genaue Beschreibung von der Probenentnahme bis zum Eindecken. Besonders die einzuhaltenden Zeiten

Gruß vom Anfänger Peter aus Lorsch

Erich T.

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Re: Botanik: Erster Versuch: Thymian *
« Antwort #11 am: Januar 04, 2016, 20:41:15 Nachmittag »
Nochmals danke für eure Rückmeldungen. Wie gewünscht noch eine Auflistung des Bearbeitungsprotokolls:

Nach Schneiden mit dem Handmikrotom mit Holundermark. Der Schnitt am Stämmchen erfolgte im oberen Teil der Pflanze, der noch nicht stark verholzt ist. Beim Blattschnitt hatte ich wohl Anfängerglück. Die Chloroplasten hätten mich eigentlich nicht sehr gestört. Werde aber beim nächsten mal versuchen zu bleichen. Hatte bisher gedacht, dass dies bei diesen Präparaten und Färbungen nicht nötig wäre - aber wie gesagt, einen Versuch ist es wert.

Fixierung in AFE: 2 Tage (Weiterverarbeitung musste ungeplant verschoben werden)
Auswaschen in Alkohol 70%: 10 min
Alkoholreihe: 50% - 3 min; 30% - 3 min
Wasser demineralisiert: 3x 1 min
Wacker 3A sim (Acriflavin/Acridinrot/Alcianblau) verdünnt 1:5: 5 min auf ca. 60° erwärmt (genaue Messung nicht durchgeführt - aber nicht bis zum Siedepunkt)
Auswaschen in Wasser demineralisiert 3x je 1 min
Entwässerung in Isopropylalkohol: 30 sec, 1 min, 3 min, 5 min
Eindecken in Euparal

Die Bearbeitung erfolgte in Uhrglasschälchen, nicht am Objektträger.

Ich hoffe ich konnte etwas Licht in die Sache bringen,

liebe Grüße
Erich

Fahrenheit

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Re: Botanik: Erster Versuch: Thymian *
« Antwort #12 am: Januar 05, 2016, 13:35:37 Nachmittag »
Lieber Erich,

danke für Deine Angaben! Dann schauen wir mal ... :)

Grundsätzlich ist der Ablauf in Ordnung, ich arbeite recht ähnlich.

- Zum Schnitt:
  Wenn Du mit Holundermark arbeitest, musst Du trocken schneiden, da das Mark sonst sehr schnell aufweicht und es seine stabilisierende Wirkung verliert.
  Hier könntest Du Möhre nehmen und Klinge und Probe bei jedem Schnitt mit Ethanol (70%) benetzen. Die Möhre lässt sich auch recht einfach zurecht schneiden
  und es gibt einen kleinen Trick beim Schneiden von Blättern.
  Hier ein paar Links:
  Zylindermikrotom: http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanische_mikrotechnik/index.html#a995
  Möhren: http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanische_mikrotechnik/index.html#a419

- Für die Schnittfixierung ...
  in AFE reichen in der Regel 20 bis 60 Minuten. wenn Du unterbrechen musst, bring die Schnitte besser in Ethanol 70%.
  Mit den Auswirkungen einer so langen Schnittfixierung habe ich keine Erfahrung. Vermutlich ist sie aber nicht der Grund für das fehlende Blau.

- Überführen in Wasser:
  ok, passt. Muss nicht so akurat sein, da die Färbelösung auch ein wenig Ethanol enthält (die Stammlösung von Acridinrot wird in 50% Ethanol angesetzt)

- Färben:
  Welche Farbmischung hast Du genau verwendet? Das Asim von Klaus, W3Asim 1 oder 2 oder selbst angesetzt? Wenn Du es selbst angesetzt hast: nach welchem Rezept bitte?
  Persönlich verdünne ich die W3Asim I u. II Mischungen mittlerweile nur noch bei kritischen Materialien, die dann aber zu der von Dir beobachteten "Rotverschiebung" neigen.
  Weiterhin sollte die Einwirkzeit eher bei 7 bis 8 Minuten liegen.
  Hier könntest Du also die Lösung unverdünnt für 8 Minuten einsetzen, das Erwärmen ist ok.

- Auswaschen:
  Versuch' es mal so: so lange spülen, bis sich das Spülwasser nur noch ganz leicht rot färbt, Einwirkzeit je etwa 20 Sekunden

- Ggf. Differenzieren:
  Das ist neu :)
  Zieh das letzte Spülwasser nur unvollständig ab (nach Gefühl, die Schnitte sollten noch gut feucht sein) und gib etwas reines Isopropanol hinzu.
  Beobachte die Schnitte im Uhrglas: die rote Farbe geht in kleinen Wölkchen ab. Mit Glück kommt darunter das vermisste Blau (oder beim W3asim II / Asim II Grün) zum Vorscheinen.
  Unterbrich den Prozess durch Absaugen der Flüssigkeit und mehrfaches Spülen mit reinem Isopropanol in schnellem Wechsel, wenn die Färbung passt.
  Vorsicht: nicht übertreiben! Schau auf den dünnsten Schnitt im Uhrglas. Die Dickeren ggf. separat weiter behandeln.

  Es geht auch sanfter: die Schnitte einfach für längere (lange :) ) zeit im Wasser lassen und gelegendlich wechseln. Dauer nach Erfahrung - 30 Minuten bis zu mehreren Stunden.

- Entwässern
  Passt. Wichtig ist, reinen Isopropanol zu verwenden, der so wenig wie möglich Wasser enthält (die Chargen von meinem Apotheker liegen alle oberhalb von 99,8%)

So, ich hoffe, ich hab' Dich nicht erschlagen :)

Herzliche Grüße
Jörg
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Erich T.

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Re: Botanik: Erster Versuch: Thymian *
« Antwort #13 am: Januar 05, 2016, 20:51:38 Nachmittag »
Für das Färben habe ich die Lösung von Klaus Herrmann verwendet. Werde beim nächsten Versuch deine Vorschläge durchprobieren.

Auf jeden Fall danke für die ausführliche Analyse und die vielen Tipps.

Liebe Grüße
Erich

Fahrenheit

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Re: Botanik: Erster Versuch: Thymian *
« Antwort #14 am: Januar 05, 2016, 21:46:48 Nachmittag »
Lieber Erich,

immer gerne und viel Erfolg!

Letztendlich ist die Ausprägung einer Färbung immer auch stark von der Probe selbst abhängig: auch wenn pflanzliche Strukturen immer aus den gleichen Gewebetypen "zusammen gesetzt" sind, so unterscheiden sie sich doch oft im Detail bezüglich Zellaufbau und Physiologie und das ist wohl der Hintergrund für die unterschiedlich ausfallenden Färbungen, wie Du sie hier im Forum ja auch an vielen Beispielen sehen kannst.
Einen kleiner Anhaltspunkt, wie eine Asim-Färbung ausschauen kann, findest Du hinter meinem Link oben zum Färbungsvergleich.

Herzliche Grüße
Jörg
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