Problem mit Etzold FCA

[Bernd Miggel]

Liebe Mikroskopiker,

zur Zeit übe ich mich an Tangentialschnitten von Kiefernholz (Pinus sylvestris).
Das Holz verwende ich direkt frisch aus dem Wald. Geschnitten wird entweder mit Tischmikrotom oder manuell mit Rasierklinge. Die Schnitte werden zum Färben direkt in Etzold-FCA überführt.
Nach dem fünfminütigen Einfärben werden sie kurz in dest. Wasser geschwenkt und in Wasser unter dem Mikroskop begutachtet.
Und hier tritt auch schon das Problem auf: Der blaue Farbanteil fießt aus den parenchymatischen Markstrahlzellen aus, siehe Fotos. So etwas habe ich bei anderen Holzarten (z.B. Abies alba) noch nie erlebt, da bleibt das Astrablau schön in den Zellen.
Auch wenn ich nach dem Einfärben direkt mit Isopropanol entwässere, fließt das Blau aus.

Was mache ich falsch? Jeder Tipp ist willkommen!

Herzliche Grüße

Bernd



Meine Ausrüstung:
Kleines Tischmikrotom von Kosmos
Olympus-BHS
Canon EOS 600D

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[Bernd Miggel]

Pardon,

hier nochmal ein Versuch, die zugehörigen Bilder einzubinden:

[knipser009]

hallo Bernd

verfahre doch einmal genau nach folgender Vorschrift , wobei Pkt 1 natürlich entfällt :

http://www.aeisner.de/methoden/farb70.html

Das Pkt 7 verwendete Isopropanal muss unbedingt das wasserfreie I. sein

[Klaus Herrmann]

Hallo Bernd,

vielleicht liegt es daran, dass du Frischmaterial verwendet hast. versuche mal die Schnitte zu fixieren. Wenn du kein AFE hast könnte auch Ethanol alleine schon helfen. Danach wässern und färben wie gehabt.

Gutes Gelingen!

[Bernd Miggel]

Hallo Wolfgang und Klaus,

vielen Dank für eure Vorschläge!
Bevor ich sie ausprobiere, habe ich auf die Schnelle noch einen anderen Versuch zwischengeschoben, und zwar die vorgeschnittenen Holzklötzchen vor dem Einfärben für zwei Stunden in Salzwasser gekocht. Vor vielen Jahren hatte ich an einem Holzbestimmungskurs teilgenommen, bei dem der Referent genauso vorgegangen war. Soviel ich weiß, sollte dadurch den Holzzellen das Wasser entzogen werden. - Hier das Ergebnis, mit dem ich erst einmal hochzufrieden bin:



Herzliche Grüße

Bernd

[Klaus Henkel]

Liebe Mikroskopiker,

zur Zeit übe ich mich an Tangentialschnitten von Kiefernholz (Pinus sylvestris).
Das Holz verwende ich direkt frisch aus dem Wald. Geschnitten wird entweder mit Tischmikrotom oder manuell mit Rasierklinge. Die Schnitte werden zum Färben direkt in Etzold-FCA überführt.
Nach dem fünfminütigen Einfärben werden sie kurz in dest. Wasser geschwenkt und in Wasser unter dem Mikroskop begutachtet.
Und hier tritt auch schon das Problem auf:

Der blaue Farbanteil fießt aus den parenchymatischen Markstrahlzellen aus, siehe Fotos. So etwas habe ich bei anderen Holzarten (z.B. Abies alba) noch nie erlebt, da bleibt das Astrablau schön in den Zellen.
Auch wenn ich nach dem Einfärben direkt mit Isopropanol entwässere, fließt das Blau aus.

Hallo Bernd Miggel!

Selbstverständlich fließt das Astrablau aus, dieser Farbstoff überfärbt immer, deshalb darf man die vier Alkoholstufen inkl. Differenzierung nicht einfach weglassen! Die Folge sieht man bei Ihren Schnitten: Astrablau ist mächtig überfärbt - sowohl bei den beiden ersten als auch bei dem zuletzt gefärbten Schnitt.

Zu Ihrer Bemerkung, bei anderen Holzarten bliebe "das Astrablau schön in den Zellen", wäre noch zu bemerken: Das Astraublau ist niemals in den Zellen, denn es färbt wie alle anderen Farbstoffe auch, nur die Zellwände an. In den Zellen befindet sich nichts, was sich anfärben ließe, die sind leer! Beim Tangentialschnitt sieht man das gut, weil die Zellwände der dünnen Holzstrahlen wegen des geringen Lumens so nahe beieinander liegen, daß sie sich zu einem tiefblauen Farbklecks verdichten. Das Blau sollte schwächer sein, eher blaß, damit man bei höherer Vergrößerung besser in die Zellen hinein und hindurch sehen kann. Dieses Ergebnis erzielt man durch die Differenzierung: Dosiertes Auswaschen mit Alk. Isopropylalkohol ist vorteilhaft. Ethanol muß nicht sein.

Fragen Sie bitte nach, wenn noch etwas unklar sein sollte.
Viel Erfolg!
KH

[Bernd Miggel]

Hallo Herr Henkel,

mir sind die vier Alkoholstufen leider nicht klar. Würden Sie mir diese Schritte bitte im Detail erklären, damit ich das ein für alle Mal richtig mache?
Herzlichen Dank!

Bernd Miggel

[knipser009]

hallo bernd

beim Mikroskopie-kollegium Bonn gibt es eine diesbezügliche Anleitung :

http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Arbeitsplan_Etzold_FCA.pdf

[Bernd Miggel]

Hallo Wolfgang,

danke für den Tipp! Aber von Differenzieren steht in dem Arbeitsplan nichts, oder habe ich das übersehen?

Viele Grüße

Bernd

[knipser009]

hallo Bernd

mit dem Begriff "Differenzieren" im Sinne einer Präparateherstellung hatte ich anfänglich auch Verständnisprobleme. Bei solchen Färbetechniken versteht man unter differenzieren die Kontrolle des Verhaltens der einzelnen Farbkomponenten beim Einwirken der versch. Lösungsmiitel auf den Gehalt der Einzelfarbstoffe. Man wägt halt ab, ob genügend des Farbstoffes "herausgezogen" ist - eine Erfahrungstatsache.

[Klaus Herrmann]

Aber von Differenzieren steht in dem Arbeitsplan nichts, oder habe ich das übersehen?

Hast du nicht lieber Bernd! Aber sonst ist die Arbeitsanleitung gut beschrieben.
Wenn du die gefärbten Schnitte nach dem Auswaschen in dest. Wasser unterm Mikroskop überprüfst und solche Überfärbungen feststellst, dann ist differenzieren angesagt. Dazu nehme ich 70%iges Ethanol und beobachte unter dem Stereomikroskop wenn möglich im Durchlicht den Fortschritt der Entfärbung. Kitzlige Sache, es ist schnell mal zu viel entfärbt mit geringeren Alkoholkonzentrationen geht es langsamer. Wenn der richtige Punkt erreicht ist sofort abstoppen in Wasser und dann die Eindekprozedur wie gehabt. Blöd ist, dass sich oft das Rot schneller verabschiedet, als das Blau.

[koestlfr]

Hallo Bernd!

Ich hätte da 2 Fragen an dich:

welche Konzentration hat die Salzlösung, in der du die vorgeschnittenen Holzklötzchen vor dem Einfärben für zwei Stunden kochst und
wie gross sind deine Holzklötzchen?

Liebe Grüße
Franz

[Gerd Schmahl]

Hallo Bernd,

vorgeschnittenen Holzklötzchen vor dem Einfärben für zwei Stunden in Salzwasser gekocht. Vor vielen Jahren hatte ich an einem Holzbestimmungskurs teilgenommen, bei dem der Referent genauso vorgegangen war.

Kann es sein, dass das mehrstündige Kochen eigentlich zum Erweichen trockener Holzproben diente? Das macht man zumindest so, um alten Holzproben (Restaurationsaufgaben) überhaupt einen einigermaßen sauberen Schnitt abgewinnen zu können, wobei eine Färbung zur Bestimmung i.d.R. nicht notwendig ist. Ein sehr schönes Buch zu diesem Thema:
D.GROSSER: Die Hölzer Mitteleuropas - Ein mikrophotografischer Lehratlas - Riprint der Originalausgabe von 1977 (ehem. Springer-Verlag). Die drucktechnisch und von den Fotos her wesentlich bessere Originalausgabe ist leider nur noch total überteuert zu bekommen.

Grosser empfiehlt allerdings das Kochen in Wasser oder in einem Grycerin-Wassergemisch zur Erweichung. Hier geht es also genau um das Gegenteil: Hier soll Wasser reingebracht werden.

Habt Ihr denn damals bei dem Bestimmungskurs auch gefärbt?

Nachdenkliche Grüße
Gerd

[Bernd Miggel]

Hallo Franz,

ein Teelöffel Kochsalz auf einen halben Liter Wasser. Aber bitte: Die Hintergründe für das Kochen in Salzwasser kenne ich nicht wirklich.
Die Klötzchen sind Stifte von 20 mm Länge und 10x10 mm Querschnittsfläche. So kann man sie bequem in das Tischmikrotom spannen oder von Hand mit Rasierklinge schneiden. Geschnitten wird die Querschnittsfläche, für jede Schnittebene also ein Klötzchen.

Das nachfolgende Foto zeigt einen Tangentialschnitt von Pinus sylvestris. Arbeitsschritte: Gefärbt fünf Minuten mit Etzold-FCA (Fa. Chemlab) mit kurzzeitigem Erhitzen, zweimal in Wasser gespült, differenziert zwei Minuten in Ethanol 70%, entwässert in drei Stufen mit Isopropanol 100%, eingebettet in Euparal.   Mir scheint das Präparat immer noch etwas überfärbt, vor allem das Blau!

Herzliche Grüße

Bernd

[Bernd Miggel]

Hallo Gerd,

das von dir angegebene Buch besitze ich selber, wirklich lesenswert!
Damals im Holzbestimmungskurs haben wir mit Toluidinblau gefärbt. Dauerpräparate sind damit auch möglich. Die Färbung nach Etzold gefällt mir allerdings wesentlich besser.

Herzliche Grüße

Bernd