Hahnenhecheln mit schöner Primärfluoreszenz

Schrodt · März 23, 2016, 16:43:29 NACHMITTAGS

peter-h · März 23, 2016, 17:14:59 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen,

ich habe nun den ersten Beitrag von dir zur Dunkelfeld Fluoreszenz angesehen, denke aber dass Du bei diesen Bildern keinen Sperrfilter genommen hast. Oder doch ? Aber welche Wellenlänge an der Kante? Ich muß doch sauber die Anregungswellenlänge von der Emissionswellenlänge trennen. Schlägt bei diesen Bildern doch noch ein Teil der Anregung durch (großer Blauanteil)?

Grüße
Peter

Schrodt · März 23, 2016, 17:45:24 NACHMITTAGS

Hallo Peter,

die Bilder sind mit folgender Kombination aufgenommen:

Anregungsfilter • BG 12/2 mm + BG 38/4 mm.

Sperrfilter • K 490 ( das führt zu einer Überschneidung, besser wäre für die Trennung K 515 oder K 530 ! , den Filter habe ich leider nicht und ich wollte auch den PLOEMOPAK mit dem Filter LP 515 nicht einsetzen).

Mir kam es hier darauf an, einen nicht aufwendigen Weg aufzuzeigen. Der Blaustich hat mich dabei nicht gestört, ich hätte ihn ja auch digital korrigieren können !

Beste Grüße

Jürgen aus Hemer

reblaus · März 23, 2016, 19:00:27 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen -

Das sind zwar sehr schöne Dunkelfeldaufnahmen, aber welchen Anteil Fluoreszenz an dem "Blaustich" hat lässt sich daraus nicht entnehmen. Dieses schöne Blau wird eigentlich meist durch UV angeregt, aber ein BG 12 lässt doch bei 495 noch so viel durch, dass eine (meist schwache) Blaufluoreszenz davon überstrahlt würde.

Viele Grüße

Rolf

Schrodt · März 23, 2016, 19:29:19 NACHMITTAGS

Hallo Rolf,

wie groß der Fluoreszenzanteil ist, kann man leider nicht genau sagen, da der Reintransmissionsgrad des BG 12 bei K490 noch etwas über o,20 liegt. Eine saubere Trennung ist daher erst beim Einsatz des Filters K 530 vorhanden.
Wenn man das von mir beschriebene Verfahren mit einem Filter K 530 oder OG 530 / 2 mm durchführt ist die Fluoreszenz einwandfrei. Das Bild wird sich allerdings dabei nicht sehr viel ändern.

Viele Grüße
Jürgen aus Hemer

peter-h · März 23, 2016, 19:56:57 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen,

wenn der Aufwand nicht zu groß ist so würde ich gerne sehen wie es mit einem OG530 als Sperrfilter aussieht. Ein BG12 mit 4mm wäre natürlich auch günstiger. Ich glaube z.Zt. nicht so recht an Fluoreszenz, sondern an "Falschlicht". Aber ich kann es natürlich nicht beweisen.

Gruß
Peter

reblaus · März 23, 2016, 20:10:25 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen -

mit der Leitz-Nomenklatur bin ich nicht sehr vertraut. Ich nehme aber an, dass K "Langpass-Kantenfilter" bedeutet. Nun lässt der K490 noch etwas Blau durch, das Fluoreszenz sein kann aber auch ein Teil des Anregungslichtes. Ein K 530 sollte allerdings keines mehr durchlassen - die Fluoreszenz müsste dann grün aussehen, wenn sie einen Grünanteil hat - oder verschwinden, wenn es sich um rein blaue Fluoreszenz handelt.

Viele Grüße

Rolf

Schrodt · März 23, 2016, 21:00:26 NACHMITTAGS

Hallo Rolf,

vielen Dank für deine informativen Anmerkungen. Von mir zur weitergehenden Information die Reintransmissionsgrade von BG 12 und BG 38 sowie
der Transmissionsgrad des Kantenfilters K 490.

Viele Grüße
Jürgen aus Hemer

Schrodt · März 23, 2016, 21:33:51 NACHMITTAGS

Hallo Peter,

deine Vermutungen " Falschlicht " kann ich nicht widerlegen. Zu dem Verfahren möchte ich jedoch ergänzend ausführen.

Der Dunkelfeldkondensor lässt die Beleuchtungsstrahlen so flach in das Präparat eintreten, dass sie das Objektiv des Mikroskops gar nicht erreichen.
Dieses nimmt nur die vom schräg angestrahlten Präparat herkommenden Streustrahlen auf. Damit erhält man in der Fluoreszenz eine saubere
Trennung von Anregungs-und Emissionsstrahlung. Nach meiner Erfahrung bringt dabei auch das nur 2mm dicke Anregungsfilter BG 12 meistens
schon brauchbare Ergebnisse. Bei dickeren Filtern reicht nach meiner Erfahrung die Leistung der Halogenlampe 12 V 100 W oft nicht aus und es sind stärkere Lichtquellen erforderlich.

Über die rege Diskussion freue ich mich.

Beste Grüße
Jürgen aus Hemer

PS. Auch das Sperrfilter kann nach meiner Erfahrung wegen der beim Dunkelfeld nur vorhandenen Streustrahlen schwächer und nicht so streng sein !

peter-h · März 23, 2016, 22:59:28 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen,

mache doch einfach einen Negativversuch. D.h. bringe z.B. ein Geflecht von einem feinen Stahlgitter oder einem Objekt, was mit Sicherheit keine Fluoreszenz zeigt auf den Objekttisch. Dann darf nach Deiner Methode doch kein Bild entstehen. Falls aber doch ..... ? Auch einfache Streupräparate von Diatomeen (wenn möglich in Caedax) könnten als Test dienen.

Achtung:
Naphrax, Styrax, ZRAX fluoreszieren ! http://www.mikroskopie-ph.de/Fluoreszenz-Medien.jpg

Ich bin gespannt.
Gruß
Peter

reblaus · März 23, 2016, 23:31:14 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen -

von dem flach eingestrahlten Licht wird ein großer Teil ganz normal in alle Richtungen gestreut und ist gar nicht an der Fluoreszenzanregung beteiligt - sonst könnte man ja gar kein normales Dunkelfeld machen. Das ist übrigens auch bei der Auflichtfluoreszenz so - auch hier muss dieses direkte Streulicht vom Sperrfilter blockiert werden.
Bei schmalbandiger UV-Anregung würde das Streulicht zwar nicht sofort stören - man sieht es ja nicht. Aber für die Augen wäre es sicher nicht gesund.

Viele Grüße

Rolf

P.S. Es gibt in der Zoologie tatsächlich mehr blaufluoreszierende Substanzen als in der Botanik, deshalb wäre es schon von Interesse diese Sache gemäß der Anregung von Peter genauer abzuklären.

Schrodt · März 24, 2016, 08:45:50 VORMITTAG

Guten Morgen Peter und Rolf,

vielen Dank für eure Hinweise und Vorschläge, ich werde diesen nachgehen und dann darüber berichten.

Beste Grüße
Jürgen aus Hemer

Schrodt · März 24, 2016, 11:00:52 VORMITTAG

Hallo Mikrofreunde,

vorab zeige ich zur weiteren Information die Ergebnisse meiner Untersuchungen von gestern Abend.

Bild 1 + 2 : Hahnenhechel mit normalem Dunkelfeld ohne Filter

Bild 3 + 4 : Hahnenhechel DL - DF - FLUO mit Violett - Anregung

Anregungsfilter: Bandpassfilter BG 3 / 3 mm (Farbe blau) siehe auch Transmissionsgrad-Diagramm Bild 5
+Bandpassfilter BG 38 / 4 mm ( Farbe helles blaugrün) als Rot-Absorptionsfilter

Sperrfilter : Langpassfilter (Kantenfilter) K 490 (Farbe gelb)

Diese Filterkombination führt zu einer besseren Trennung zwischen Anregungsfilter und Sperrfilter sowie
zur Unterdrückung der Nebendurchlässigkeit im roten Spektralbereich.

Bild 5 : Transmissionsgrad-Diagramm von Filter BG 3 / 3

Viel Vergnügen beim Anschauen.

Beste Grüße
Jürgen aus Hemer

reblaus · März 24, 2016, 13:44:05 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen -

sehr schönes Dunkelfeld und Blau! Mich wundert nur, das Dein Sperrfilter (Kantenfilter gelb, 490 nm) solch ein prächtiges Blau überhaupt durchlässt - meine beiden hellgelben Kantenfilter (davon einer Interferenz) lassen nur blaugrün durch, obwohl deren Kante sogar bei 470 nm liegt.

Viele Grüße

Rolf

peter-h · März 24, 2016, 15:10:58 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen,

es gibt auch noch einen Punkt zu bedenken. Die Schott GG-Filter haben teilweise eine unangenehme Eigenfluoreszenz.

GG17 ist als stark fluoreszierend bekannt und dient nur als Referenz.

Die gezeigten Filter wurden von einer UV-LED @ 365nm durchleuchtet. Damit sieht man auch, dass selbst über 550nm noch ein Anteil an Strahlung bei dieser Nichia UV-LED abgegeben wird. Weniger Eigenfluoreszenz haben die alten Kodak Wratten Filter Z.B.: UV-Sperrfilter 2B mit einer Kante bei 410nm.

Ich will heute noch am Spektralfotometer eine Kombination von BG3 / 3mm + BG38 / 4mm + GG495 / 1mm (oder GG515 / 1mm) messen um zu sehen wie gut bei der Anregung die Sperrfilter wirken. Ich hoffe ich schaffe es noch.

Gruß
Peter