Paramecium bursaria, Fluoreszenz mit Doppelfärbung

[paramecium]

In Tümpelproben und Moosrasen findet man immer wieder Paramecium bursaria. Diese Paramecium Art lebt symbiontisch mit Zoochlorellen, woran man die Art auf Anhieb meist schon grob einordnen kann. Auch sonst weist P. bursaria viele Charakteristika der Paramecium Familien auf, wie die typischen beiden pulsierenden Vakuolen. Diese Eigenschaften lassen die genauere Art und Abgrenzung von anderen Arten der Ciliaten zu, welche ebenfalls Zoochlorellen tragen können.

Diesesmal ist es mir gelungen auch ein weiteres, wichtiges Merkmal von Paramecium herauszuarbeiten: Die Trichocysten. Diese Zellorganellen stellen quasi die "Bewaffnung" von Paramecium dar. Die lanzettförmigen Organellen sind in Ruhe unter der Cuticula (Zellmembran) eingelagert. Typischerweise stellen Zellkern und pulsierende Vakuolen optische "Hohlräume" im lichtmikroskopischen Bild dar, so dass die Trichocysten hier nicht von Abbildungen anderer Organellen überlagert sind. In der Quetschpräparation legen sie sich hier etwas unordentlich durcheinander, während man am Vorderende der Zelle (oben) erkennen kann, dass sie ansonsten geordnet nebeneinander unter der Zellmembran aneinander gereiht erscheinen. In der Ausschnittsvergrößerung der Phasenkontrastaufnahme kann man die längliche Form und Struktur der Trichocysten in der lebenden Zelle gut erkennen (dunkle, lanzettförmige "Stifte").

Die weiteren Aufnahmen zeigen Studien der Zellorganellen des gleichen Individuums in Fluoreszenz. Hier wurde eine Doppelfärbung mit Acridinorange (AO) und einem zweiten Kernfarbstoff Ho342 durchgeführt. Bei UV-Anregung werden die Zellkerne deutlich blau von Ho342 gefärbt. Ciliaten haben einen Kerndimorphismus, was bedeutet, dass es neben einem (oder mehreren) Macronuclei (=Großkerne) meist einen oder mehrere Micronuclei gibt. Mitunter ist die Anzahl der Kerne auch ein Bestimmungsmerkmal der verschiedenen Arten. Gelegentlich tritt Blaufärbung auch in den Nahrungsvakuolen auf, welche durch Färbung der DNA aufgenommener Bakterien, Hefen oder anderer Organismen in der Nahrungsvacuole entsteht. So findet man bei Bakterienfressern auch stäbchenförmige Bakterien in der Nahrungsvakuole, aber auch symbiontische oder parasitierende Bakterien im Zellplasma.

Ferner treten bei UV-Anregung einige Zellbestandteile teils durch Eigenfluoreszenz hervor. Die Zerlegung der mittels Blauanregung erhaltenen Aufnahme in ihre Farbkanäle, Grün und Rot, zeigt sehr schön, welche Teile der Zelle von den beiden Fluorochromen gefärbt erscheinen und welche offenbar bei UV-Anregung Autofluoreszenz zeigen. Überall dort, wo der Grünauszug und die UV-Aufnahme keine deckungsgleichen Strukturen zeigen, muss man von Autofluoreszenz ausgehen. P. bursaria ist ein spezieller Fall, bei dem die in der Zelle eingelagerten Zoochlorellen bereits im Hellfeld grün durch ihre Chloroplasten hervortreten. Chlorophyll fluoresziert ebenfalls bei UV und Blauanregung, allerdings in roter Farbe. Daneben sieht man in grün weitere von Acridinorange gefärbte Organellen und auch vage den gefärbten Zellkern. Typisch für viele Ciliaten ist, dass man den Zellkern mit AO oftmals ungefärbt findet. Dies liegt an speziellen biochemischen Mechanimsmen der die Organellen und auch den Kern umgebenden Membranen der Organellen, welche mehr oder weniger durchlässig sind für verschiedene Stoffe und Farbstoffe, und so die Anlagerung der Farbstoffe blockieren oder abschwächen können.

Die Abbildung rechts unten schließlich ist eine Photomontage der UV Abbildung mit dem Rotkanal der mit Blauanregung gewonnen Abbildung.

Erklärt ist die Autofluoreszenz der Zellen teils durch aufgenommene Nahrung in den Nahrungsvakuolen, teils durch zelleigene Substanzen, welche bei UV Bestrahlung fluoreszieren.

Besonders hübsch erscheinen die rot gefärbten Zoochlorellen in der Blauanregung und lassen die Zelle durch die Tiefenschärfe plastisch wirken. Überhaupt bietet die Fluoreszenzmikroskopie von allen lichtmikroskopischen Verfahren die eindrucksvollsten, räumlichen Abbildungen von lebenden Zellen.

Die UV Aufnahme geschah mit etwas zeitlichem Versatz zu den übrigen Aufnahmen. Man erkennt hier zudem rechts unten im Bild, dass das Paramecium eine Nahrungsvakuole in das Umgebungsmedium entleerte (Defäkation). Hier fällt besonders die Autofluoreszenz der verdauten und entleerten Nahrungsinhalte auf.

Nicht immer gelingen solche längeren Beobachtungen von Ciliaten mit Zoochlorellen in Fluoreszenz. Gerade Zellen mit Zoochlorellen reagieren sehr empfindlich auf hohe Lichtintensität und man kann in Videoaufnahmen gelegentlich den völligen Zusammenbruch des Cytoskeletts beobachten, was meist zum spontanen Zerfall der Zelle führt, gelegentlich begleitet von Lichtblitzen im Zellplasma, welche durch Autofluoreszenz von biochemischen Reaktionsprodukten unter Lichteinfluss entstehen.

Legende:

Ma = Macronucleus (großer Zellkern)
Mi = Micronucleus (kleiner Zellkern)
pV = pulsierende Vacuole
Tri = Trichocysten
ZChl = Zoochlorellen
Def = Defäkation

Aufnahme 1: Hellfeld, N-Achroplan 20x/0,45 Ph2



Aufnahme 2: Fluoreszenz, Plan-Neofluar 40x/0,75 Ph2, vergrößern: http://microinformatics.net/images/mikroskopie-forum/P.bursaria-FL.jpg
Von links oben nach rechts unten: Phasenkontrast, UV-Anregung (Emission: 385 nm), Blauanregung (Emission: 470 nm), Grünauszug (470 nm), Rotauszug (470 nm), Montage der UV-Anregung mit dem Rotkanal der Blau-Anregung. Bedingt durch Bewegung der Zelle und Plasmaströmungen in der Zell sind manche Zoochlorellen zwischen den beiden Fluoreszenzaufnahmen gewandert und liegen nicht mehr ganz deckungsgleich mit den "Löchern" vor dem Zellkern.

Zeiss AxioLab.A1 FL LED, Auflichtfluoreszenz mit AHF Tripelband-Fluoreszenzfilter (Anregungsbanden: 385, 470, 560 nm), Anregung mit Zeiss LED 470 nm sowie selbst gebauter UV-Beleuchtung mit einer Nichia LED NVSU233A, 385 nm.

[Holger Adelmann]

Sehr schön geworden 

[Michael]

Hallo Thilo,

Glückwunsch zu den sehr schönen und klaren Färbeergebnissen.
Ich hätte erwartet, dass auch Du auch von den  Zellkernen der Zoochlorellen ein Signal bekommst. Kannst Du sagen, warum diese nicht mit dem Kernfarbstoff gefärbt werden?

Viele Grüße

Michael

[Oecoprotonucli]

Hallo Thilo,

sehr interessant!

...Und ich wollte fragen, ob Du sicher bist, dass die grüne Fluoreszenz von DNA in Nahrungsvakuolen kommt. Ich fragte mich, ob evtl. auch z.B. mitochondriale DNA gefärbt sein könnte - aber nach dem Lesen von Michaels Frage könnte es vielleicht auch DNA der Zoochlorellen sein? (Das sind Fragen, keine Feststellungen. Man bräuchte noch mal eine Ausschnittsvergrößerung mit etwas Verstärkung des grünen Kanals bei der Überlagerung der beiden Kanäle. ...Und ich müsste noch mal nachlesen, wie autonom bzw. eben nicht autonom die Zoochlorellen noch sind - werden sie aufgenommen oder vererbt?)

Viele Grüße

Sebastian

[Bernhard Lebeda]

Hallo Thilo,

sehr interessant!

...Und ich wollte fragen, ob Du sicher bist, dass die grüne Fluoreszenz von DNA in Nahrungsvakuolen kommt. Ich fragte mich, ob evtl. auch z.B. mitochondriale DNA gefärbt sein könnte - aber nach dem Lesen von Michaels Frage könnte es vielleicht auch DNA der Zoochlorellen sein? (Das sind Fragen, keine Feststellungen. Man bräuchte noch mal eine Ausschnittsvergrößerung mit etwas Verstärkung des grünen Kanals bei der Überlagerung der beiden Kanäle. ...Und ich müsste noch mal nachlesen, wie autonom bzw. eben nicht autonom die Zoochlorellen noch sind - werden sie aufgenommen oder vererbt?)

Viele Grüße

Sebastian

Hallo Sebastian

Zoochlorellen haben wir schon oft diskutiert. z.B.:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=5219.0



@Thilo: wirklich sehr schöne Ergebnisse; besonders die Darstellung der "blauen" Kerne gefallen mir sehr.

Kleine Anmerkung zu den Trichozysten: nach meinem Kenntnisstand ist es etwas umstritten, diese Organellen als Bewaffnung oder gar Selbstverteidigungsmittel zu interpretieren. Der "Abschuss" der Trichozysten erfolgt ja immer quasi als letzte Aktion vor dem Exitus der Zelle. Die Funktion gilt als ungeklärt. Sollten Dir neuere Erkenntnisse vorliegen, nehme ich diese sofort in mein Halbwissen auf! 


Viele Mikrogrüße

Bernhard

[Oecoprotonucli]

Hallo Bernhard,

Danke! (Ich sag' ja: muss ich nachlesen, da war auch schon mal etwas, das ich inzwischen wieder vergessen habe.) So ähnlich haben es die Mitochondrien oder Chloroplasten wohl laut Endosymbiontentheorie auch mal ins Zellinnere geschafft...

Bei solcher noch nicht vollständigen Abhängigkeit müsste ja dann bei den Zoochlorellen schon DNA zu erwarten sein (kann sein, dass ich auch hier wieder nachlesen muss, bin ja schon still...)

Viele Grüße

Sebastian

[Oecoprotonucli]

...noch etwas:

Acridinorange soll ja auch RNA färben (oft gehört, aber noch nicht selbst gemacht). Könnte dann die rote Färbung der Zoochlorellen nicht auch statt Chlorophyll-Fluoreszenz RNA sein (bzw. beides)?

Viele Grüße

Sebastian

[Bernhard Lebeda]

Bei solcher noch nicht vollständigen Abhängigkeit müsste ja dann bei den Zoochlorellen schon DNA zu erwarten sein (kann sein, dass ich auch hier wieder nachlesen muss, bin ja schon still...)

...die Frage haben wir hier in der Tat noch nicht diskutiert. Finde ich auch interessant. Nimm mal diese Diskussion:


http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?2,38669,38669#msg-38669


Detelf Kramer sagt darin:

Lieber Wolfgang,

die Chlorellen aus P. bursaria sind tatsächlich Chlorellen, wobei ich nicht die Hand dafür ins Feuer lege, das alles, was Chlorella ist, auch wirklich zu einer Gattung gehört. Aber Du weißt ja, wie schwierig diese Abgrenzungen zu treffen sind. Jedenfalls kann man die Chlorellen isolieren und dann wachsen sie wie normale Chlorellen, bis sie von bestimmten Viren befallen werden, denn davor sind sie nur in ihrem Wirt geschützt. Eine spannende Geschichte, die aber hier nicht hingehört.

Das spricht eigentlich dafür, daß die DNA erhalten bleibt, warum auch nicht. Da der Hauptteil der Algenzelle von Chloroplasten ausgefüllt sind, überdeckt deren Rotfluoreszenz die der DNA/RNA wahrscheinlich. Aber warten wir was Thilo sagt!

Viele Mikrogrüße

Bernhard

[Oecoprotonucli]

Hallo Thilo,

vielen Dank für die gute Erklärung! Also reicht es nicht, über Acridinorange mal zwei Sätze bei Wikipedia zu lesen...

Besten Gruß

Sebastian

[Bernhard Lebeda]

Bernhard,
nach meiner Einschätzung dienen Trichocysten bei Paramecium eher zur Selbstverteidigung. Oder sie werden abgeworfen wenn es ungemütlich wird oder die Zelle bereits in Auflösung ist. Etwas anderes konnte auch ich noch nicht beobachten.

Gruß

Thilo

Hallo Thilo

ich hab noch mal ne Runde gelesen und in der Tat ist der neueste Stand eher zu Gunsten der Fressfeindabwehr-Theorie. Man muss dazu allerdings wissen, daß darüber eine jahrzehntelange Diskussion unter Ciliatenforschern im Gange ist. So heißt es z.B. In "Paramecium -a current survey" Elsevier 1974  S.22/23:

" If the mechanism of their extrusion is known, their functions are still obscure; their burst does represent a reaction to an excitation (mechanical, physical or chemical), but it can hardly be considered to play a defensive role."

Dies ist so mehr oder weniger der Ténor bis 1990. in diesem Jahr führten Haacke-Bell et al. Versuche mit "Wildformen " von Paramecien gegenüber trichozystenlosen Mutanten durch. Die Mutanten wurden um 45x häufiger Opfer ihrer Fressfeinde Dileptus und Monodinium als die Trichozysten abschiessenden Wildformen! Allerdings NICHT gegenüber dem klassischen Fressfeind Didinium! Hier gab es keinerlei Unterschiede, Didinium liess sich durch die Trichozysten nicht abschrecken! Trotzdem ist der Stand der Lehrmeinung eher in Richtung Selbstverteidigung/Fraßschutz.


Vielleicht noch zwei interessante biologische Fakten zu den Trichozysten: ein Paramecium Individuum besitzt 6000-8000 solcher Extrusomen (sic!). Wenn sie abgeschossen werden sind sie um den Faktor 7 länger als im Ruhezustand im Cortex!!


Viele Mikrogrüße

Bernhard


konsultierte Literatur:

"Paramecium-A Current survey" Elsevier 1974

"Ciliates - Cells as organisms" Hausmann/Bradbury G.Fischer 1996

"The Ciliated Protozoa" Lynn Springer 2008

" Protozoologie" Hausmann Thieme Verlag 1985

" Protistology" Hausmann/Hülsmann/Radek Schweizerbartsche Verlagsbuchhandlung 2003

[Michael]

Hallo Thilo,

das fehlende Kernsignal von den Zoochlorellen und die Diskussion, ob sie überhaupt DNA enthalten ging mir nicht aus dem Kopf. Also habe ich mir ein paar P. bursaria gefangen und eine "klassische" Färbung (allerdings "quick and dirty") mit Eisenhämatoxylin nach Weigert durchgeführt, um die Zellkerne zu markieren. Dabei zeigen sich die Kerne der Zoochlorellen recht deutlich sind aber recht klein (ich musste schon das 100er auspacken um brauchbare Fotos zu erhalten). Anhand von Fotos habe ich sie ausgemessen. Der Kerndurchmesser beträgt ca. 1µ bei einer Zellgröße von 4µ-5µ. Viel Signal sollte man also von den Kernen nicht erwarten.
Ich verstehe zu wenig von Fluoreszenz-Mikroskopie und Deinen Aufnahmebedingungen, um zu beurteilen, ob da überhaupt eine Chance bestünde, die Kerne der Zoochlorellen zu sehen, zumal das Signal wohl auch stark abhängig von der Entfernung zur Fokusebene sein dürfte (1/r² ?).
Zumindest ist es eindeutig, dass die Zoochlorellen DNA enthalten.

Viele Grüße

Michael

[Oecoprotonucli]

Hallo Michaeil,

toll, dass Du "mal eben" ein paar Paramecien gefangen hast und nach den Kernen geschaut hast - und sie entdeckt hast!

Falls Du Deine Fotos hier einstellen willst, hat sicher niemand etwas dagegen   .

Ich sehe keinen Grund, warum Fluoreszenmikroskopie im Allgemeinen nicht ausreichen sollte, um kleine Strukturen anzufärben, im Gegenteil: Dinge, die man sonst nicht erkennt, leuchten deutlich auf, und die moderne hochauflösende und superauflösende Mikroskopie beruht in vielen Fällen auf Fluoreszenz, manchmal leuchten einzelne Moleküle und man fängt die Signale ein.

Man wird also vermutlich auf die Einzelbedingungen schauen müssen. Thilo hat ja wohl eine in-vivo-Färbung gemacht, während Du fixiert (und permeabilisiert?) hast. (Und Bernhard sagte es ja auch: Vielleicht wird das schwächere Signal nur von der Rotfluoreszenz des Chlorophylls überdeckt.)

Schönen Tag

Sebastian

[Michael]

Hallo Sebastian,

wenn denn ein Beweisfoto notwendig ist... 



Die Ciliaten wurden mit Formaldehyd fixiert und mit Eisenhämatoxylin gefärbt. Die obere Reihe zeigt den gesamten Organismus. Unten ist jeweils eine Ausschnittsvergrößerung, bei der der Kontrast nachbearbeitet wurde. Da die Färbezeit leider zu lange war, ist bei den Aufnahmen der Hintergrund überstrahlt.
Bei den Ausschnitten glaube ich, die Zellkerne der Zoochlorellen deutlich zu erkennen.

Thilo, bitte entschuldige, dass ich in Deinem schönen Beitrag Fotos einstelle. Wenn es Dich stört, sage bitte Bescheid - ich werde dann das Foto wieder entfernen.

Viele Grüße

Michael

[Bernhard Lebeda]

Hallo Sebastian,

wenn denn ein Beweisfoto notwendig ist... 

...das nicht, aber ein Foto ist immer schöner als Worte 


toll wie Du sowas immer auf die Schnelle hinkriegst. Ich muss solche Experimente auch mal anstellen.

Wobei der kritische Naturwissenschaftler hier sicher anmerken würde: Kerne hast Du schön dargestellt, aber ein DNA Nachweis ist dann ja noch nicht.

Viele Mikrogrüße

Bernhard

[Eckhard]

Hallo,

Zur Frage der DNA in den Zoochlorellen habe ich noch ein paar ergänzende Informationen. Natürlich haben die Zoochlorellen eigene DNA. Wenn man P. bursaria im Dunkeln kultiviert, sterben die Zoochlorellen nach einem Weilchen ab und werden verdaut. Werden die farblosen Paramecien dann in eine Kultur gegeben, in denen Chlorella Algen sind, sind sie nach einem Weilchen wieder grün.

Die Algen werden gefressen und manipulieren dann den Verdaungsvorgang des Parameciums, so dass sie nicht verdaut werden, sondern als Symbionten weiterleben. Sie können sich sogar im Parameciums teilen und vermehren. Erstaunlicherweise wird sogar das kleine Bläschen, die ehemalige Nahrunsgvakuole, nach der Teilung der Alge geteilt, so dass jede Alge ihr eigenes kleines Heim hat. 

Die Anzahl der Protisten, deren Verdauungssystem durch die Algen überlistet werden kann, ist sehr hoch. Neben verschiedenen Ciliaten können auch viele Amöben und Sonnentierchen symbiontische Algen haben. Manche Arten treten in der Natur immer mit Zoochlorellen auf. Auf www.penard.de ist sogar Amoeba proteus mit Chlorellen zu sehen.

Ich hatte einmal etwa 20 Cochliopodium Amöben (mit Zoochlorellen) und ein Sonnentierchen (ohne Zoochlorellen) in einer Probe. Die Probe habe ich in der feuchten Kammer etwa eine Woche erhalten und regelmäßig beobachten können. Die Cochliopodien starben nacheinander und das Sonnentierchen teilte sich. Am Ende waren es 10 Sonnentierchen, nun alle mit Zoochlorellen. Ich habe dabei beobachtet, wie ein Sonnentierchen vor der offenen Hülle eines Cochliopodiums saß. Die Hülle war, bis auf die Zoochlorellen, leer. Ein Axopodium des Sonnentierchens ragte in die Hülle hinein und es "fischte" nach den Zoochlorellen. Ich habe noch zwei Tage kontrolliert, ob die Sonnentierchen die Algen verdauen. Wenn die Algen verdaut werden, verändert sich die rote Autofluoreszenz des Chlorophylls in eine bräunchliche, die irgendwann weg ist. Nach zwei Tagen zeigten die Zoochlorellen immer noch leuchtend rote Autofluoreszenz. Die selben Symbionten sind also vom Cochliopodium zu den Sonnentierchen "gewandert". Das finde ich höchst bemerkenswert.

Herzliche Grüße
Eckhard