Schiefe Beleuchtung und Analyse eines komplizierten Präparates

[Carlos]

Hallo zusammen,
Ausgehend von der von KH. angegebenen Literatur habe ich weitere, interessante Beiträge zur ,,schiefen Beleuchtung" in IN gefunden. Für mich besonders interessant sind die Beiträge von Dr. Martin Kreutz (,,Kreutz-Blende") und Gerhard Göke , nachzulesen bei der ,,Naturwissenschaftlichen Vereinigung Hagen e. V" (NWV).
Für mich ist die ,,schiefe Beleuchtung" jetzt interessanter als zuvor.
Anmerkung: In diesem Faden wurde des öfteren mit dem Begriff ,,Artefakt" operiert, und zwar als Nachteil für Verfahren, die Derartiges erzeugen. Nimmt man die Definitionen von  ,,Wiki" , sind praktisch alle Mikroskopieverfahren ,,Artefakt" erzeugend (Phasenkontrast-, DIK-, Elektronenmikroskop-, etc.).
Erst durch die Diskussion in diesem Faden wurde mir klar, was KH in seinem Beitrag mit

Die Schiefe Beleuchtung wurde seit ca. 1880 besprochen und viel angewandt. In der Wissenschaft heute kaum noch, weil das Bild meist irreale Artefakte zeigt, die von Anderen nicht reproduzierbar sind. Deshalb wird in der Wissenschaft heute nicht mehr diskutiert, weil sie an Artefakten nicht mehr interessiert ist.

wohl meinte: nicht erklärbare und von anderen nicht reproduzierbare Artefakte und nicht Artefakte als solche. Wenn dem so ist, dann hat er m. E. vollkommen recht.
Ob Artefakte bei ,,schiefer Beleuchtung" auch heute nicht erklärbar und nicht reproduzierbar sind, daran habe ich allerdings Zweifel.
Gruß Carlos


Gruß Carlos

[Klaus Henkel]

Ob Artefakte bei ,,schiefer Beleuchtung" auch heute nicht erklärbar und nicht reproduzierbar sind, daran habe ich allerdings Zweifel.
Gruß Carlos

Sobald man einen Kondensor aus der mittigen Position bringt, um Schiefe Beleuchtung zu erzeugen, ist das für einen anderen Mikroskopiker nicht reproduzierbar. Er müßte ja wissen, um vieviel Grad der K. in welche exakte Richtung bewegt wurde, mit welchem Objektiv bei exakt welcher Apertur, mit welcher Kondensorapertur, mit welcher Ablenkungsblende (keilförmig, linsen- oder mondsichelförmig usw usf. Das alles und noch viel mehr müßte exakt beschrieben sein, damit es jemand anders nachmachen kann. Selbst ein Foto hülfe da wenig, weil auch dann die Kondensoreinstellungen bei einem anderen nicht nachgeahmt werden könnten, selbst wenn es sich um dasselbe Kondensormodell handelte.

D. h., was der erste Mikroskopiker beschreibt und was er im Foto oder in einer Zeichnung darstellt, was er also gesehen zu haben glaubt, das muß ein zweiter nicht zwangsläufig ebenso sehen. Damit ist eine Nachprüfung von Behauptungen mit wissenschaftlich einwandfreien Methoden, nicht möglich. Bei Hellfeld, ja sogar bei Phasenkontrast (sofern der Ph-Kondensor korrekt eingestellt wurde) ist das anders, nämlich reproduzierbar, es kann von jemand anders überprüft werden.

Früher wurden die Kondensoren graduiert, mit einer Öffnungsskala ausgestattet, umwenigstens die K.apertur "nachzuempfinden", doch ist der reale Vorteil dadurch sehr gering, so daß es deswegen und aus Kostengründen heute praktisch keine Skalen mehr an Kond. gibt. Es sind einfach zu viele Einstellkriterien, die sehr exakt nachgemacht werden müßten.

Daß es Wissenschaftler gibt, welche die Schiefe Beleuchtung gerne verwenden, ist überhaupt kein sachliches Argument. Wir hatten auch hier im Forum schon Diskussionen, die sich über viele Monate, manchmal Jahre hinzogen, weil selbst die bei schief.Bel. gemachten Beweisfotos, von beinahe allen anderen Diskutanten zurecht nicht anderkannt werden konnten.

N.B.: Ich liebe die Schiefe Beleuchtung, verwende sie regelmäßig, weil sie einfach schöne Bilder erzeugen kann. Aber ich bin kein Wissenschaftler.

Vielleicht können Sie mal probehalber über Ihren Schatten springen und - solange sich Ihr mikroskopisches Wissen noch im Anfangsstadium befindet - einfach hinnehmen, was mehrere Generationen von Physikern und Praktikern in der sehr reichhaltigen und anerkannten mikr. Fachliteratur in 150 Jahren dargelegt und begründet haben.

Morgengrüße!
KH

[rhamvossen]

Hallo Herr Henkel,

Er müßte ja wissen, um vieviel Grad der K. in welche exakte Richtung bewegt wurde, mit welchem Objektiv bei exakt welcher Apertur, mit welcher Kondensorapertur, mit welcher Ablenkungsblende (keilförmig, linsen- oder mondsichelförmig usw usf

. Bei Hellfeld, ja sogar bei Phasenkontrast (sofern der Ph-Kondensor korrekt eingestellt wurde) ist das anders, nämlich reproduzierbar, es kann von jemand anders überprüft werden.

Sie meinen eigentlich: bei Hellfeld kann Jederman die Aperturblende auf exakt der Gleiche Weise oeffnen oder? Nicht ungefaehr, nicht 2/3 bis 3/4 aber exakt 75%. Aber den auch 100% genau oder? Das es in die Literatur genug Hellfeld Bilder gibt mit zu stark zugezogener Aperturblende moechte bekannt sein. Aber das da moeglich Artefakten zu sehen sind, davon werde die meiste Wissenschaftler warscheinlich gar keine Ahnung haben. Beste Gruesse,

Rolf

[Oecoprotonucli]

Hallo Herr Henkel,

ich habe keinen Überblick oder gar Statistik über die Verwendung derartiger Methoden (Schieflicht, DIC, Phako) in wissenschaftlichen Veröffentlichungen, auch habe ich Schieflicht noch nicht ausprobiert, obwohl das auch auf meiner (hobbymäßigen) To-Do-Liste steht.

Dennoch meine ich sagen zu können, dass es auch in der Wissenschaft erlaubt ist, z.B. eine Struktur zu suchen, wenn die Methode dabei hilft - und das soll schiefe Beleuchtung doch, oder? Oder sind die besagten Artefakte so schlimm, dass man eigentlich gar nichts sicher identifizieren kann? Dann frage ich mich natürlich, ob die Methode reine Spielerei ist und nur schöne Dinge ohne große Erkenntnis zeigt - ähnlich wie die Polarisationsmikroskopie in einigen biologischen Präparaten zwar gern bestaunt wird, aber nicht besonders viel in der biologischen Forschung zu erzählen hat.

Außer Frage steht natürlich, dass man so etwas nicht für quantitative Auswertungen benutzen sollte, wenn die Einstellungen so schlecht reproduzierbar sind. Aber auch die Wissenschaft braucht ja manchmal (noch) qualitative, anwendungsorientierte Methoden - auch wenn der Trend zu Molekülen und Quanten und Statistik hin geht. Und sparen muss man im Labor auch (z.B. sich überlegen, ob man DIC anschafft - da gibt es ja IMC = integrated modulation contrast, und HMC = Hoffman modulation contrast, die wohl billigere Alternativen dazu darstellen).

Besten Gruß

Sebastian

[carypt]

Dann muß ich auch was sagen . hallo .
Bei der schiefen Beleuchtung hat man ja einen Schattenwurf zur Seite (und nicht zum Betrachter) . Die kreisend umlaufende Beleuchtung assoziiert bei mir zur Computertomographie  , nur ist der Analysator nicht aufgereiht hinter dem Präparat sondern senkrecht  zur Beleuchtungsrichtung .
Wie würde denn ein Beleuchtungsumlauf der schiefen Beleuchtung als Stack der gleichen Fokusdistanz aussehen ?
gruß carypt

[Lupus]

Hallo Carlos,

mir scheint, dass bezüglich der schiefen Beleuchtung hier zwei Dinge vermengt werden: Dir ging es vermutlich nur um die Methode, die Auflösung zu erhöhen, die allgemein übliche Anwendung der schiefen Beleuchtung ist aber die Verwendung als Phasenkontrastverfahren. Beides sind mögliche Effekte mit der gleichen Bezeichnung und ähnlicher Technik, basieren aber physikalisch auf unterschiedlichen Grundlagen. Im ersten Fall geht es primär um Beugung und Interferenz, im zweiten Fall um Lichtbrechung.

Der Versuch einer Erklärung für den ersten Fall:

Man nehme ein einfaches Präparat an, z.B. bestehend ausschließlich aus gleichgroßen kreisrunden strukturlosen Blutkörperchen, Bakterien o.ä.
Das ganze wird mit parallelem Licht parallel zur optischen Achse beleuchtet (entsprechend einer fast ganz geschlossenen Aperturblende). Wegen der gleichgroßen Objekte wird das Licht in einem kegelförmigen, festem Winkel symmetrisch zum Beleuchtungsstrahl gebeugt (Beugung 1. Ordnung, mit doppeltem Winkel die Beugung 2. Ordnung usw.), das alle Informationen über die Form und Größe enthält. Wenn die numerische Apertur des Objektives nun kontinuierlich vergrößert wird bis die Lichtstrahlen 1. Ordnung vollständig erfasst werden, sind die Objekte erkennbar, aber mit unscharfer Kontur. Wird die Apertur weiter vergrößert bis zur Erfassung der 2. Beugungsordnung und weiterer Ordnungen, steigt die Detailtreue der Randabbildung kontinuierlich an. Das ist der Anteil der Auflösung nur durch das Objektiv. Den meisten ist die Formel für die Auflösung eines Mikroskopes bekannt, die aus zwei Anteilen, der NA des Objektives und der NA der Beleuchtung besteht. Der zweite Anteil wäre in unserem Fall mit parallelem Licht =0. Vom Objektiv wird maximal das gebeugte Licht mit einer NA = NA des Objektives erfasst.

Lässt man alternativ den parallelen Beleuchtungsstrahl schräg zur optischen Achse einfallen (max. im Winkel der NA des Objektives damit der Strahl noch in das Objektiv eintreten kann) dann wird max. der doppelte Beugungswinkel durch den gegenüberliegenden Objektivrand erfasst, also die Auflösung verdoppelt. Das wäre also der idealisierte Effekt einer maximalen schrägen Beleuchtung, und die kann kegelförmig umlaufen um diese Auflösungssteigerung in allen Bildrichtungen zu erhalten.

Die normale Beleuchtung eines Kondensors mit offener Aperturblende besteht hingegen aus der Summe paralleler Strahlen mit allen möglichen Winkeln zur optischen Achse, die beiden vorher beschriebenen extremen Beispiele eingeschlossen. Die maximal mögliche Auflösung der reinen schiefen Beleuchtung ist also bereits enthalten, aber wegen der Mischung verschiedener Beleuchtungswinkel mit einem prozentual geringeren Anteil der höchsten Beugungswinkel. Gleichzeitig werden durch den erhöhten Anteil der ungebeugten Beleuchtung, die jetzt die ganze NA des Objektives ausleuchtet, die Bildinformationen in den Beugungsordnungen bildlich gesagt stärker "überstrahlt". Insgesamt ist daher die max. Auflösung schräger Beleuchtung zwar "enthalten", aber mit geringem Kontrast. Aus diesem Grund wird ja regelmäßig der Kondensor etwas abgeblendet, um auf Kosten der Auflösung den Kontrast zu erhöhen.

Leider entsteht bei einer Beleuchtung mit engem Strahlwinkel ein zusätzlicher Effekt: Das Licht wird zunehmend kohärent, es entstehen u.a. Interferenzen zwischen einzelnen Bildanteilen. Das ist der bekannte Effekt des scheinbar hohen Bildkontrastes beim Abblenden der Aperturblende, es entstehen Artefakte, die nicht vorhandene Bildinformationen vortäuschen (siehe Ende dieser Diskussion: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25346.30). Und das tritt auch bei starker schiefer Beleuchtung auf. Man kann die Effekte zwar heutzutage theoretisch herausrechnen, aber dazu müssten erstens die Randbedingungen exakt bekannt sein (Interferenz reagiert sehr empfindlich auf kleinste Abweichungen), außerdem muss die Pixelauflösung des Bildsensors wesentlich über der zu erzielenden Bildauflösung liegen, sonst wird die Berechnung durch Bildrauschen dominiert. Da kann man genauso gut die auflösungsbegrenzende Beugung durch sog. Dekonvolution direkt herausrechnen. Ein besonderer praktischer Vorteil der schiefen Beleuchtung zur Erhöhung der Auflösung ist daher - außer vielleicht in Spezialfällen - für mich nicht erkennbar.

Hubert

[treinisch]

Hallo Hubert,

vielen Dank, sehr erhellende Analyse!

Deinen Punkt mit ,,Auflösung bereits enthalten" habe ich verstanden, aber vor allem beantworten die Kurven in dem anderen Thread eine Frage, die mich die ganze Zeit beschäftigt: Was sind das für Artefakte.

Du zeigst ein Artefakt, ganz klar, allerdings ist genau das ein Artefakt, dass man mit einer typischen Bildbearbeitung, die auch für gern für mikroskopische Aufnahmen angewandt wird, absichtlich herstellt (Hochpass) und du schreibst ja auch, dass man diese Artefakte durch Abblenden absichtlich herstellt.

Das wirft Fragen hinsichtlich der These Artefakte -> unwissenschaftlich, bzw. wissenschaftlich ungeeignet auf.

Hast Du zufällig spannende Links zum Thema ,,Da kann man genauso gut die auflösungsbegrenzende Beugung durch sog. Dekonvolution direkt herausrechnen." griffbereit?

vlg

Timm

[Carlos]

Hallo zusammen,
Hallo Hubert,

Dir ging es vermutlich nur um die Methode, die Auflösung zu erhöhen, die allgemein übliche Anwendung der schiefen Beleuchtung ist aber die Verwendung als Phasenkontrastverfahren.

Nein Hubert, das ist so nicht richtig. ,,Schiefe Beleuchtung" hat für einzelne Teile des Zwischenbilden eine deutliche Erhöhung der Auflösung, abhängig u.A. von der Stellung bzw. Richtung  der dezentrierten Blende zum Objekt, zur Folge,  erkauft allerdings damit, dass das Bild anderer Teile des Objekts geringer aufgelöst ist. Meine Überlegung ging dahin, dass durch Aufnahme von Bildern mit unterschiedlichen Richtungen der  dezentrierten Blende und anschließender Überlagerung der Bilder das gesamte Objekt im Bild höher aufgelöst erscheint. (Genau das ist in der von KH angegebenen Literatur (H. Ullrich, 1983,)  bereits vor mehr als 30 Jahren mechanisch gelöst.)

...die allgemein übliche Anwendung der schiefen Beleuchtung ist aber die Verwendung als Phasenkontrastverfahren. Beides sind mögliche Effekte mit der gleichen Bezeichnung und ähnlicher Technik, basieren aber physikalisch auf unterschiedlichen Grundlagen. Im ersten Fall geht es primär um Beugung und Interferenz, im zweiten Fall um Lichtbrechung.

Das kann ich nicht nachvollziehen. Dies widerspricht m. E. den Erklärungen zu den beiden Methoden sowohl in der ,,Mikofibel"  wie auch den Ausführungen von D. Gerlach (Das Lichtmikroskop ..., 1976).
(Auch Dein Erklärungsversuch hat daran, trotz mehrfachen Lesens, leider nichts geändert, da ich offensichtlich vieles davon bereits begrifflich nicht verstanden habe.)
Gruß Carlos

[Lupus]

Hallo Timm,

Du zeigst ein Artefakt, ganz klar, allerdings ist genau das ein Artefakt, dass man mit einer typischen Bildbearbeitung, die auch für gern für mikroskopische Aufnahmen angewandt wird, absichtlich herstellt (Hochpass) und du schreibst ja auch, dass man diese Artefakte durch Abblenden absichtlich herstellt.

wenn das bewusst so gemacht wird, also das Abblenden übertrieben wird, dann ist das m.E. unzweifelhaft unwissenschaftlich.

Hast Du zufällig spannende Links zum Thema ,,Da kann man genauso gut die auflösungsbegrenzende Beugung durch sog. Dekonvolution direkt herausrechnen." griffbereit?

Das ist eine von mir begründete These. Die Problematik der Dekonvolution kenne ich aus der Praxis, ich habe selbst so etwas programmiert und verwendet (allerdings nicht in der Mikroskopie. Hier anscheinend auch niemand, meine Frage in dem Thread http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=20831.0 blieb erwartungsgemäß unbeantwortet). Zum Vergleich mit der rechnerischen Beseitigung der Artefakte schiefer Beleuchtung glaube ich aber nicht, dass es speziell Links dazu gibt, das ist doch ein zu exotisches Thema.

Hubert

[Lupus]

Hallo Carlos,

Dir ging es vermutlich nur um die Methode, die Auflösung zu erhöhen, die allgemein übliche Anwendung der schiefen Beleuchtung ist aber die Verwendung als Phasenkontrastverfahren.

Nein Hubert, das ist so nicht richtig.

Was ist daran nicht richtig, es ging Dir doch um die Erhöhung der Auflösung?

...die allgemein übliche Anwendung der schiefen Beleuchtung ist aber die Verwendung als Phasenkontrastverfahren. Beides sind mögliche Effekte mit der gleichen Bezeichnung und ähnlicher Technik, basieren aber physikalisch auf unterschiedlichen Grundlagen. Im ersten Fall geht es primär um Beugung und Interferenz, im zweiten Fall um Lichtbrechung.

Das kann ich nicht nachvollziehen. Dies widerspricht m. E. den Erklärungen zu den beiden Methoden sowohl in der ,,Mikofibel"  wie auch den Ausführungen von D. Gerlach

In welchem Punkt widerspricht das diesen Erklärungen?

Hubert

[carypt]

Wie die mikroskopie.de-seite vom Forumhoster Christian Linkenheld auf dieser Seite: http://www.mikroskopie.de/pfad/kontrastverfahren/zwei.html beschreibt , erzeugen alle transparenten Objekte Phasenunterschiede , vor oder hinter dem Präparat gäbe es dann konstruktive oder destruktive Interferenz des gebeugten und direkten Lichtes , also hell-dunkel Artefakte . Die sieht man auch , wenn man bei Hellfeld über oder unter dem Fokus liegen tut .
recherchiert .

[carypt]

@carlos :

(Genau das ist in der von KH angegebenen Literatur (H. Ullrich, 1983,)  bereits vor mehr als 30 Jahren mechanisch gelöst.)

wo finde ich dies genau ? Ist der Name H. Ulrich richtig ? Ist es dies Verfahren http://www.google.de/patents/WO1995029420A1?cl=de  https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf;jsessionid=3F52A0AED52DC1EBC4869C3E123ABB91.wapp2nB?docId=WO1995029420&recNum=1&tab=Drawings&maxRec=&office=&prevFilter=&sortOption=&queryString=. Mich würde ja ein Bild dazu interessieren , deshalb möchte ich genauer googlen .
gruß carypt

[RainerTeubner]

Hallo carypt,

in der von Dir zitierten Offenlegungsschrift sind doch Patentzeichnungen veröffentlicht, die das Prinzip des Verfahrens gut verdeutlichen.

Viele Grüße

Rainer

[carypt]

ja , aber das ist Hans-Ulrich Dodt  und nicht H.Ullrich , außerdem interessiert mich ein Bild der Überlagerung der unterschiedlichen Beleuchtungsrichtungen zu finden .   

[Lupus]

Hallo carypt,

wo finde ich dies genau ? Ist der Name H. Ulrich richtig ?

das hat Herr Henkel angegeben: Mikrokosmos 72, 1983, S. 21-23.

Diese ganzen Verfahren, egal wie man sie nennt und variiert, laufen auf das gleiche hinaus: Ein Teil des Lichtes, das in der maximalen Beleuchtungsaptertur Kondensors enthalten ist, wird durch verschieden geformte Blenden geblockt um Licht möglichst von einer Seite kommend und nur mit hoher numerischer Beleuchtungsapertur durchzulassen. Die Unterschiede bestehen nur darin, dass jeweils andere Kontrasteffekte und andere Artefakte erzeugt werden. Wenn sich relativ einfach zu verwirklichende Verfahren nach 20 bzw. 30 Jahren noch nicht durchgesetzt haben, dann wird vermutlich der Vorteil gering sein.

Eine Ergänzung: Ich hatte in meinem Beitrag von zwei Methoden der Verwendung schiefer Beleuchtung gesprochen, zur Erhöhung der Auflösung und als Phasenkontrastverfahren. Mit der zweiten hatte ich eigentlich die Schlierenmethode mittels schiefer Beleuchtung gemeint, die geringere Artefakte erzeugt, und die primär nicht auf Beugung beruht.

Hubert