Autor Thema: Botanik: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer *  (Gelesen 3767 mal)

Rolf-Dieter Müller

  • Member
  • Beiträge: 926
Liebe Mikrogemeinde,

es ist an der Zeit, mich wieder aktiver im Forum zu beteiligen. Allein die schönen Schnitte und Bilder der letzten Monate sind Anreiz genug auch wieder tätig zu werden.

Mein Axioskop 20 ist aufgebaut, und um die mir möglichen Verfahren zu testen, respektive neu zu justieren, habe ich mir einen Farn-Wedelstängel vorgenommen. Der verspricht nämlich eine relativ intensive Autofluoreszenz. Zusätzlich wollte ich auch hiermit eine Direktadaption für Mikroaufnahmen testen. Als Kamera nahm ich hierfür meine alte Panasonic G3, die über einen MFT/T2-Adapter direkt (das heißt ohne Projektiv) an die Zeiss-Trennstelle 60 angeschlossen wurde.

Die Schnitte habe ich mit dem Haga-Rasierklingenmikrotom gemacht. Keine große Herausforderung trotz des kleinen Stängel-Durchmessers von ca. 0,8 mm, wenn man ein 3 cm langes Stück mit 1 cm Überstand mit Tesafilm an Holundermark fixiert und dieses Päckchen Schnitt für Schnitt im Vorschub nach oben treibt. Die Schittdicke liegt irgendwo zwischen >30 µm und <50 µm, was für Querschnitte von Stängeln hinreichend ist.


Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. aleuticum 'Imbricatum')

Den Farn gab es als Topfpflanze vom Restetisch eines lokalen Pflanzengeschäftes. Wo das Stängel-Stück heraus geschnitten wurde ist im Bild gekennzeichnet.

Als erstes möchte ich die Bilder vom lebendfrischen Querschnitt präsentieren. Der Schnitt ist also nicht fixiert und auch nicht gefärbt.

Das sind Aufnahmen mit
  • Hellfeld
  • Polarisation
  • Auflicht-Fluoreszens mit Blauanregung


Hellfeld: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. aleuticum 'Imbricatum'), Wedelstängel quer, Plan-Neofluar 40x, Objektiv und Kondensor mit Wasser immergiert. 19 Einzelaufnahmen zu diesem Gesamtbild zusammengefügt.


Polarisation: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. aleuticum 'Imbricatum'), Wedelstängel quer, Plan-Neofluar 16x, Objektiv und Kondensor mit Wasser immergiert. 2 Einzelaufnahmen zu diesem Bild zusammengesetzt.


Auflichtfluoreszenz, Autofluoreszenz mit Blauanregung: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. aleuticum 'Imbricatum'), Wedelstängel quer, Plan-Neofluar 16x, Objektiv und Kondensor mit Wasser immergiert. Dieses Bild ist zusammengesetzt aus 2 Einzelaufnahmen.


Als nächstes dürfte dann doch noch eine kleine Herausforderung kommen. Die überzähligen Schnitte sollen zu einem gefärbten Dauerpräparat verarbeitet werden. Aber das wird noch einige Tage dauern.

Viele Mikrogrüße,
Rolf-Dieter
« Letzte Änderung: April 02, 2017, 22:20:09 Nachmittag von Fahrenheit »

koestlfr

  • Member
  • Beiträge: 936
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #1 am: März 28, 2017, 20:32:46 Nachmittag »
Hallo Rolf-Dieter!

Schöne Schnitte, super gefärbt und abgelichtet - Hut ab!

Einzige Anregung - mich stört diese Riesenschrift in dem geschmackvollen, ungefärbten Schnitt!
« Letzte Änderung: März 30, 2017, 07:37:52 Vormittag von koestlfr »
Liebe Grüße
Franz

A. Büschlen

  • Member
  • Beiträge: 1966
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #2 am: März 28, 2017, 22:04:14 Nachmittag »
Hallo Rolf-Dieter,

schön, wieder einmal etwas von deiner Schneide- und Färbearbeit zu sehen. Besonders das dritte Bild zeigt  eindrücklich, wie du mit deinem Haga-Mikrotom schneiden kannst.

Gruss Arnold

Rolf-Dieter Müller

  • Member
  • Beiträge: 926
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #3 am: März 29, 2017, 12:09:14 Nachmittag »
Hallo Arno und Franz,

vielen Dank für Eure freundlichen Kommentierungen.

@Franz, ein Bild aus einer Serie muss ich immer mit Maßstabsbalken und Objektbeschreibung kennzeichnen, damit ich später noch nachvollziehen kann, was ich überhaupt gemacht habe. Aber Du hast recht, etwas kleiner könnte die Schrift schon sein. Ich werde das bei meinen künftigen Bildern berücksichtigen.

Die ersten drei Bilder zeigen ja denselben naturbelassenen Schnitt, nur mit jeweils geänderten Beleuchtungsverfahren, nämlich Hellfeld, Pol und Fluoreszenz. Die Fluoreszenz ist ohne Netz und doppelten Boden, eine Auto- oder auch Primärfluoreszenz. Für mich die Königin der verschiedenen Fluoreszenzanwendungen.

Zum gefärbten Schnitt kommen wir jetzt, den ich noch gestern Abend als Wacker-Färbung in folgenden Arbeitsschritten gemacht habe.

  • Die Schnitte aus Wasser in AFE(70)-Lösung fixiert. Die Fixierlösung ist ein Gemisch aus 90 Teile 70%iges Ethanol + 5 Teile 100%iges Eisessig + 5 Teile 37%iges Formalin. Fixierdauer 3 Stunden, 15 Minuten hätten auch gereicht.
  • Fixierlösung mit Wasser ausgewaschen.
  • Wacker simultan färben, 5 Minuten. Währenddessen die Farblösung mit den Schnitten erwärmen, bis man einen leichten Essiggeruch bemerkt. Die Geruchsprobe ist nur ein Merkmal, denn Essig muss nicht unbedingt aus der Farblösung ausgetrieben werden.
  • Schnitte in Wasser auswaschen. Wasser mehrmals wechseln bis keine Farbe mehr abgeht.
  • Differenzieren in 70% Ethanol, mehrmals wechseln bis keine Farbe mehr abgeht.
  • Entwässern in 100% Isopropylalkohol, mehrmals wechseln.
  • Einschluss in Euparal.

Hinweis zum Wasser: Ich nehme nur Leitungswasser, dafür aber abgekocht, um darin enthaltene Gase auszutreiben.



Mit Wacker simultan gefärbter Schnitt: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. aleuticum 'Imbricatum'), Wedelstängel quer, Plan-Apochromat 20x. Dieses Bild ist zusammengesetzt aus 4 Einzelaufnahmen.

Und was zeigt uns das nun? Das Präparat ist für die Tonne. Ein Objektträger wird als Beleg zurückgelegt, die restlichen sind schon entsorgt.

Aber warum? Denn die farbdifferenzierte Darstellung ist schon ganz ordentlich. Für eine Wackerfärbung vermisse ich aber mehr reinere Farben, zum Beispiel fehlt mit hier Blau und/oder Grün. Das Gelb wirkt mir einfach zu schmutzig.

Aber das kann man ändern, wenn statt mit 70% Ethanol mit Salzsäurealkohol differenziert wird. Leider habe ich gestern Abend alle meine Schnitte für diese Färbung aufgebraucht, überzählige wurden verworfen.

Da hilft nur eins, neue Querschnitte schneiden und das Ganze noch einmal, aber dann mit Salzsäurealkohol differenzieren.

Bis dahin viele Mikrogrüße,
Rolf-Dieter

koestlfr

  • Member
  • Beiträge: 936
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #4 am: März 29, 2017, 15:08:34 Nachmittag »
Hallo Rolf-Dieter!

Ich bin nach wie vor baff, wie perfekt Du mit der "Blechdose" schneidest!

Aber sag mal: man kann doch auch mit 40%-igem Alkohol differenzieren, das differenziert stärker - ich habe bisher noch nie Salzsäurealkohol verwendet?

Du schreibst: "Primärfluoreszenz, für mich die Königin der verschiedenen Fluoreszenzanwendungen", für mich dann aber doch eher Richtung 365nm, weil da bereits mehrere Zellsubstanzen fluoreszieren.
« Letzte Änderung: März 30, 2017, 07:42:27 Vormittag von koestlfr »
Liebe Grüße
Franz

Eckhard

  • Member
  • Beiträge: 2126
    • Vorstellung
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #5 am: März 31, 2017, 21:42:45 Nachmittag »
Lieber Rolf-Dieter,

Schön, von Dir mal wieder einen Schnitt zu sehen! Ich glaube, Dein Astrablau hat nicht gewirkt. Du scheinst etwas aus der Übung ;)

Was sind das für Neofluare? Die Multiimmersions Objektive? Wenn ja, meine besten Glückwünsche! Das Fluoreszensbild ist großartig und sehr plastisch.

Herzliche Grüße aus Berlin,
Eckhard
Zeiss Axioscope.A1 (HF, DF, DIK, Ph, Pol, Epifluoreszenz)
Nikon SE2000U (HF, DIK, Ph)
Olympus SZX 12 (HF, DF, Pol)
Zeiss Sigma (ETSE, InLens SE)

www.wunderkanone.de
www.penard.de
www.flickr.com/wunderkanone

Rolf-Dieter Müller

  • Member
  • Beiträge: 926
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #6 am: April 01, 2017, 17:04:30 Nachmittag »
Liebe Mikrogemeinde, es geht weiter und wir kommen zu einer Lösung des Färbeproblems.

Zuerst möchte ich aber auf die vorstehenden Kommentierungen antworten.

@Franz, ja ich komme immer wieder auf diesen „Metallkasten“ zurück weil ich damit schnell hinreichend dünne Querschnitte erziele. Zugegeben, einfach Probe einklemmen und darauf losschneiden geht nicht, es kommt immer wieder auf die richtige Probenvorbereitung und Handling beim Schneiden an.

Zum Differenzieren: Eigentlich komme ich immer mit 70% Ethanol aus und beende es dann gleich mit der Endstufe von Isopropylalkohol. Nur wenn das nicht reicht, nehme ich Salzsäurealkohol. Aber Du hast recht, 40% Ethanol geht auch recht gut man kann es mit schonender Entwässerung in Ethanolstufen aufsteigender Konzentration verbinden.

Anregung mit 365 nm von nativen Präparaten ist ja ebenfalls Primärfluoreszenz und somit königlich. Ich bevorzuge aber Blauanregung bei botanischen Präparaten. Ist eben für Chlorophyll optimiert und lass mich dann überraschen, was sonst noch alles kommt. Jedenfalls hat es sich bei diesem Farn gelohnt.

@Eckhard, das fehlende Blau oder Grün war ein typischer Präparationsunfall, was gerne passiert, wenn man etwas länger aussetzt.

Ja, die Plan-Neofluare sind Multiimmersions-Objektive. Das 16x ist übrigens mein Lieblingsobjektiv, seinerzeit von Dir empfohlen. Lang ist es her, aber vielleicht erinnerst Du Dich ja noch. Das 40x habe ich erst letztes Jahr angeschafft. So ganz habe ich mich mit dem Objektiv noch nicht angefreundet. Im Ergebnis fehlt mir das etwas. Aber vielleicht kommt das noch mit der Zeit.


Jetzt zurück zum Pfauenradfarn, insbesondere zur Färbung.

Neue Schnitte habe ich gemacht, genauso wie oben beschrieben gefärbt, nur nach der Färbung und dem Waschen in Wasser gleich mit Salzsäurealkohol differenziert. Salzsäurealkohol ist ein Gemisch von 100 ml 70% Ethanol + 0,5 ml Salzsäure.

Es hat nicht viel gebracht, außer dass die Färbung etwas klarer wirkt, dafür aber das Acridinrot zurückgegangen ist. Eine Aufnahme erspare ich mir, denn in etwa kann man sich dafür an die obige Färbung orientieren.

Was aber mehr geholfen hat ist ein Überblick mit einer ganz anderen Färbung, um zu sehen was wie kommt. Hierfür verwende ich gerne Etzold FCA, insbesondere weil ich es reichlich vorrätig habe. Etzold FCA ist ein Farbgemisch aus Fuchsin, Chrysoidin und Astrablau und bei mir fast ein Jahrzehnt alt, geht aber immer noch.

Blau kommt also, wie nachstehende Aufnahme zeigt.


Mit Etzold FCA gefärbter Schnitt: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. aleuticum 'Imbricatum'), Ausschnitt Wedelstängel quer, Plan-Neofluar Imm. Korr. 40x, Objektiv und Kondensor mit Wasser immergiert.

Und jetzt kommt die Erinnerung. Ich habe einmal mit Wacker Simultanfärbung experimentiert und ein verbliebenes Fläschchen mit Farblösung erwischt. Leider habe ich darüber keine Aufzeichnungen mehr und die Flasche war im Detail nicht beschriftet.

Aber alles wird gut. Denn Jörg hatte mir einmal ein Fläschchen anlässlich eines seiner legendären Workshops überlassen. Und so kommen wir zu einer Wacker-Simultanfärbung, wie sie zu erwarten ist:


Mit W3Asim II gefärbter Schnitt: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. aleuticum 'Imbricatum'), Ausschnitt Wedelstängel quer, Plan-Neofluar Imm. Korr. 16x, Objektiv und Kondensor mit Wasser immergiert. Zusammengesetzt aus vier Einzelaufnahmen.

Die beiden zuletzt gezeigten Färbungen habe ich genauso wie in meinem zweiten Beitrag beschrieben präpariert.


Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

Eckhard

  • Member
  • Beiträge: 2126
    • Vorstellung
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #7 am: April 02, 2017, 10:48:40 Vormittag »
Lieber Rolf-Dieter,

Das 40x Imm hat einen zu kleinen Arbeitsabstand und eine zu geringe Schärfentiefe für die meisten Anwendungen. Ich weiß nicht, wann ich es das letzte Mal benutzt habe. 16x und 25x sind jedoch großes Kino.

Herzliche Grüße,
Eckhard
Zeiss Axioscope.A1 (HF, DF, DIK, Ph, Pol, Epifluoreszenz)
Nikon SE2000U (HF, DIK, Ph)
Olympus SZX 12 (HF, DF, Pol)
Zeiss Sigma (ETSE, InLens SE)

www.wunderkanone.de
www.penard.de
www.flickr.com/wunderkanone

Fahrenheit

  • Global Moderator
  • Member
  • Beiträge: 5901
    • Mikroskopisches Kollegium Bonn
Re: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer
« Antwort #8 am: April 02, 2017, 22:19:46 Nachmittag »
Lieber Rolf-Dieter,

so ein Fläschchen habe ich auch noch, der Ansatz enthielt deutlich zu wenig Astrablau. :)
Schön, dass die Färbung mit der zweiten Lösung noch tut.

Deinen Beitrag mit der schönen Autofluoreszenz habe ich in die Liste Botanik übernommen.
Und nun, wo Du wieder dabei bist: gerne mehr :)

Herzliche Grüße
Jörg
Hier geht's zur Vorstellung: Klick !
Und hier zur Webseite des MKB: Klick !

Arbeitsmikroskop: Leica DMLS
Zum Mitnehmen: Leitz SM
Für draussen: Leitz HM

vbandke

  • Member
  • Beiträge: 466
  • Osborn's law: variables won't; constants aren't
    • Webseite
Re: Botanik: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer *
« Antwort #9 am: April 10, 2017, 18:27:06 Nachmittag »
Guten Abend, Rolf-Dieter,

Herzlichen Glückwunsch zum "Foto des Monats", besonders herzlich, weil es zum Herz im Zentrum des Bildes passt :)

Mit besten Grüßen


Volker
P.S. Alle meine Bilder dürfen/sollen kommentiert, verrissen, gelobt, und zur Veranschaulichung in diesem Forum auch bearbeitet werden.

reblaus

  • Member
  • Beiträge: 4001
Re: Botanik: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer *
« Antwort #10 am: April 11, 2017, 11:22:04 Vormittag »
Hallo Rolf-Dieter -

herzlichen Glückwunsch an Dich und mein Lob an das Gremium für die scharfsichtige Auswahl!
Da die Primärfluoreszenzen im Frischmaterial meist eher schwächlich sind, werden sie ja meist zu Gunsten der nur ästhetisch relevanten Sekundärfluoreszenzen von Farbstoffen vernachlässigt.
In diesem Fall ist die Intensität der Primarfluoreszenz wirklich verblüffend - zumal "nur" mit Blau angeregt wurde, was aber wohl der Rotfluoreszenz des Chlorophylls zugute kommt und das Photosynthesesystem nicht so zügig umbringt wie dies oft bei 365 nm der Fall ist.

Viele Grüße und die besten Wünsche für weitere Untersuchungen an Farnen und ihren fluoreszierenden Inhaltsstoffen!

Rolf

Wutsdorff Peter

  • Member
  • Beiträge: 1612
Re: Botanik: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer *
« Antwort #11 am: April 11, 2017, 19:09:51 Nachmittag »
Guten Abend Rolf-Dieter,
Du hast ja tolle Bilder gezeigt! Daß Du die Schnitte mit dem HAGA-Mikrot. gemacht hast, finde ich super.
Du schreibst, daß die Schnitte  zwischen 30 und  50 µm dick sind.
Ich habe auch ein HAGA-Mikrot.. Die Messungen mit einer Meßuhr haben bei mir 50µm/Rasterung ergeben.
Wie hast Du kleinere Dicken als 50µm bewerkstelligt, und wie hast Du die tatsächliche Dicke der Schnitte ermittelt? Meine Methoden dazu habe ich hier schon vorgestellt.
Ich habe die Klingenführung außer Betrieb gesetzt und kann durch freies Führen der Klinge somit die ganze Länge der Klinge zum Schneiden ausnutzen.
Dein Trick mit dem Tesafilm und Holunder interessiert mich. Kannst Du bitte einmal ein Bild zeigen.
Wenn ich nur eine Rasterung (alo 50µm) als Vorschub wähle, kommen keine vernünftigen Schnitte zustande.
Vielleicht muß ich doch den Andrückfederdraht wieder entfernen. Aber ohne diesen Draht ging es mit 50µm auch nicht.

Gruß  Peter
 

Ronald Schulte

  • Member
  • Beiträge: 1735
    • De wereld onder de microscoop
Re: Botanik: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel quer *
« Antwort #12 am: April 11, 2017, 22:08:43 Nachmittag »
Rolf-Dieter,

Gratuliere, du zeigst schöne scharfe Bilder, topp.

Gruße Ronald
Mikroskope:
Leitz Orthoplan (DL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotome:
A&O 820 Rotationsmikrotom.
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

Rolf-Dieter Müller

  • Member
  • Beiträge: 926
Re: Botanik: Krauser Pfauenradfarn (Adiantum pedatum var. ...) – Wedelstängel
« Antwort #13 am: April 12, 2017, 12:36:48 Nachmittag »
Hallo Volker, Rolf, Peter und Ronald,

vielen Dank für Eure Kommentierungen und sie bestätigen mich, so weiterzumachen, wie ich hiermit nach meinem Wiedereinstieg begonnen habe.

@Rolf, Frauenhaarfarn (Adiantum capillus-veneris) zeigt auch diese intensive Autofluoreszenz. Ist halt die gleiche Familie.

@Peter, die Schnittdicke habe ich nach Merkmalen abgeschätzt und sind Erfahrungswerte über unzählige Schnitte.  >30 µm heißt für mich, die Schnitte zerfallen nicht. Ein Richtwert für Stängelquerschnitte von frischem Material sind 30 µm ohne dass die Schnitte zerfallen. Natürlich gibt es Stängel die dünner geschnitten werden und bei diesem Pfauenradfarn, geschnitten mit dem Schlittenmikrotom, wäre ich bestimmt auf festeingestellte und reproduzierbare 25 µm runtergegangen. 50 µm ist für mich der obere Richtwert, da ich keine doppelten Zelllagen in den Schnitten habe, wenn ich nur mit einer Rastung Vorschub schneide. Das reicht mir für meine Färbungen vollkommen. Wie ich das Schnittgut mit Holundermark fixiere habe ich mal bei einem Moosstämmchen gezeigt: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=11173.msg81650#msg81650 . Für dickere Stängel kann man Holundermark längs einkerben, so dass er nicht zerdrückt wird. Darüber hinaus teile ich das Holundermark längs und kann somit von der Präparatehalterung sicher fixierend angedrückt werden. Peter, versuch Dich doch einmal an Nadelquerschnitte von der Schwarzkiefer. Bei der hier beschriebenen Probenvorbereitung sollten Schnitte mit einer Rastung Vorschub und einer frischen Rasierklinge sicher zu erzielen sein. Vielleicht sollte ich einmal ein Demo-Video machen, so wie ich mit dem Rasierklingenmikrotom umgehe, dann wird sicherlich vieles klarer zu erkennen sein. Jörg wäre auch bereit, das Video auf der MKB-Seite zu stellen, wie er mir auf der Rückfahrt von der Konrade 14 anbot. Mal schauen.

Viele Grüße
Rolf-Dieter

Wutsdorff Peter

  • Member
  • Beiträge: 1612
Kiefernnadel
« Antwort #14 am: April 12, 2017, 21:39:12 Nachmittag »
Guten Abend Rolf-Dieter,
hier mein kümmerlicher Versuch mit Nadeln.

Kiefernadel aus dem Lorscher Wald
   

     

Nadel   XXX??? vom Berner Oberland 1200m ü NN
       

Ich bewahre die Holunderstäbchen in Isopropan. auf, dann lassen sie sich besser längs spalten.
Dann wird die Nadel eingeklemmt und geschnitten.
Auch ich habe die Efahrung gemacht, daß die R-klingen schnell stumpf werden.
Aber sie kosten kein Vermögen.

          Gute Nacht wünscht Peter aus Lorsch