Auflösungsverluste beim Eindecken von Präparaten

[Ralf Feller]

Auflösungsverluste beim Eindecken von Präparaten

Liebe Kollegen, ich habe ein Problem beim Eindechen von Zellausstrichen und dann wohl auch beim Einschluss von Histoschnitten.
Ich arbeite viel im der Knochenmakdiagnostik. Wir sehen uns da meist Knochenmarkausstriche in Pappenheimfärbung ohne Deckglas meist mit einem 63x PlApo an, wobei das Öl direkt auf das Präparat geschmiert wird. Die Übersichtsaufnahmen werden mit einem 10x Trockenobjektiv durch das Öl fotographiert (suboptimal).

Besonders schönschöne Präparate decke ich aber manchmal in EntellanNeu ein, um sie zu schützen, aber auch um sie mit einem hochapperturigen  Trockenobjektiv ohne die Ölerei ansehen zu können.
Nun weiß ja Jeder, das die Deckglasdicke die auf dem Objektiv, meist mit 0,17mm angegeben ist, eingehalten werden sollte. Aber da ist ja noch das Eindeckmittel. Ist es zu viskös dann wird die Schicht dicker und die Morphologie wird viel schlechter.

Vor einer Woche habe ich einfach in Entellan eingedeckt und bei 40 C unter Beschweren mit Münzen getrocknet. Die Präparate waren unbrauchbar und auch mit einer Ölimmersion nicht mehr zu gebrauchen. Ein Schuss Xylol (2 Tage warten bis das Gemisch homogen ist) brachte dann schon bessere Ergebnisse (Abb 1), die aber weit hinter meiner Referenz (Immersionsöl unter das Deckglas anstelle von Entellan (Abb 2) zurück blieben.

Abb 1: Leitz Pl Fluotar 40, Na 0,70
Knochenmark (Folsäuremangel) mit verdünntem Entellan eingedeckt.


Abb 2: wie oben,  an Stelle des Entellan habe ich Immersionsöl verwendet.


Es ist mir dann auch klar geworden, dass dieses Problem des zu viskösen Eindeckmittels dann auch in der Histologie zum Tragen kommt.

Hat jemand eine einfache Idee wie man die Einschlussmittel in ihrem Harzgehalt konstant halten kann. Es steht ja die Dichte drauf. Aber in kleinen Fläschchen abwiegen und langsam Xylol zutropfen scheint mir zu aufwendig.

Grüße aus Mülheim, Ralf

[Michael L.]

Hallo Ralf,

verwende Deckgläser die dünner als 0,17 sind um somit das Eindeckmittel in die Korrektur mit einzubeziehen. Bei Ausstrichen die in der Dicke ja sehr homogen sind dürfte das doch sehr gut gehen. Mal sehen was die Experten hier noch dazu sagen.

Viele Grüße,

Michael

[Detlef Kramer]

Hallo Ralf,

vielleicht habe ich Deine Frage ja nicht richtig verstanden. Das Xylol verdunstet doch vollständig innerhalb weniger Tage. Also kann es durchaus sinnvoll sein, das Eindeckmittel etwas zu verdünnen. Auf jeden Fall bedeutet es, dass das optimale Ergebnis erst nach einiger Zeit erreicht wird. Eine andere Sache, auf die ich immer wieder stoße: wenn man Deckgläser ohne ausdrückliche Dickenangabe kauft, haben die stets die durchscnittliche Dicke von 0,15 mm, d.h. da ist das Einschlussmittel schon in gewisser Weise einkalkuliert. Noch etwas: eine Münze reicht nicht aus, es sei denn Du nimmst die kürzlich geklaute Goldmünze von ca. 3 kg Gewicht  . Versuch es mal mit einer schweren Schraubenmutter oder sogar mit einer Wäschklammer. Moderates Erwärmen dürfte auch nicht falsch sein.

Herzliche Grüße
Detlef

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

ich vermute, Du benutzt sehr große Deckgläser.

Bei 24x36 mm Deckgläser verwende ich zwei dicke Schrauben zur Beschwerung von insgesamt ca. 30 gr.

Das Einschlussmittel muss eventuell verdünnt werden, damit es sich gut verteilt und der Übeschuss herausgepresst werden kann.

Das Gewicht sollte gleichmäßig auf dem Deckglas verteilt werden. Ich erreiche das mit einem kleinen stabilen planen Klötzchen zwischen Deckglas und Gewichten.

Entellan hat zwar den Vorteil schnell zu trocknen, aber auch den Nachteil einer niedrigen Brechzahl. Versuche einmal Malinol, vielleicht auch Depex, das bei großen Deckgläsern allerdings dazu neigt, dass beim Einschließen leicht Luftblasen unter dem Deckglas verbleiben, die beim Trocknen nicht verschwinden sondern sich schnell zu Luftinseln ausweiten. Man muss das Deckglas sehr vorsichtig und langsam auflegen.

Schöne Grüße

Jürgen

[Herbert Dietrich]

Hallo Ralf,

vielleicht solltest Du einfach mal ein anderes Eindeckmittel versuchen, vielleicht den/das alte Caedax?


Lieber Detlef,

Du bist überführt! Du hast die 100 kg Goldmünze geklaut und in kleine Münzen umgeschmolzen, oder?

Goldige Grüße
Herbert

[Bob]

Eine andere Sache, auf die ich immer wieder stoße: wenn man Deckgläser ohne ausdrückliche Dickenangabe kauft, haben die stets die durchscnittliche Dicke von 0,15 mm

Hallo zusammen,

darauf würde ich mich so nicht verlassen. Ich hatte bei ebay runde Deckgläser gekauft, die gewaltig streuten: Zwischen 0,17 bis 0,24mm.
Aus kommerzieller Sicht ist es am wahrscheinlichsten, dass man bekommt, was spezifiziert ist:
A) eng spezifizierte Selektion, hoher Preis oder
b) weit spezifiziert, das was der engen Spezifikation nicht entspricht

@Ralf: Wenn Du keine Bügelmessschraube hast, kann ich Dir gerne ein paar Deckgläser ausmessen. Geht ansonsten auch mit dem Feintrieb des Mikroskops.

Viele Grüße,

Bob

[JB]

Abb 2: wie oben,  an Stelle des Entellan habe ich Immersionsöl verwendet.

Hallo Ralf,

Also Objekt - Immersionsoel - Deckglas?

Dann scheint wirklich das Einschlussmittel das Problem zu sein. Ich wuerde es mit einem traditionellen Einschlussmittel versuchen, dessen Brechungsindex (getrocknet!) naeher bei 1.52 liegt.

Ausserdem entwaessere ich meine Blutausstriche (auch nach Lufttrocknung) immer noch mal mit Xylol. Das hift auch dabei, das Einschlussmittel besser fliessen zu lassen.

Beste Gruesse,

Jon

[momotaro]

Werden da nicht Äpfel mit Birnen verglichen:

Ein Planfluotar Trockenobjektiv NA 0.70 mit einem immergierten Apochromaten NA 1.40 (?), wenn der Kondensor nicht immergiert ist NA ~ 0.9.

LG
Helmut

[Ralf Feller]

Liebe Kollegen,
vielen Dank für die vielen Tipps,
aber es liegt wirklich am Xylolgehalt des Entellans, denn neu gekauftes Entellan funktioniert perfekt auch ohne dass ich das Deckglas beschwere (Präparate werden wie mit Immersionsöl). Das Problem taucht auf wenn unkontrolliert im laufe der Zeit Xylol verdunstet. Gebe ich zu wenig Xylol dazu, dann wird die Schicht unter dem Deckglas immer zu dick. Ich nehme natürlich nicht immer eine Münze, sondern verwende meine Kupferreserven aus 2 und 5 Cent Stücken, immer so zwei Türmchen aus 5-10 Münzen pro Deckglas und lege die Träger dann bei 40C auf die Trockenbank. Vielleicht sollte doch noch ein Holzblöckchen darunter, das werde ich ausprobieren.
Gebe ich bei Ausstrichen zu viel Xylol zum Entellan, dann bekomme ich später Bereiche aus denen sich das Eindeckmittel zurückgezogen hat. Die sind dann auch nutzlos. Wie Jon schon schreibt, hilft es wenn das Präparat schon Xylolfeucht ist. Ich sehe das an Histoschnitten, die sich besser eindecken lassen. Trotzdem besteht das Problem auch hier. Ich habe mir mit dickem und dünnem Entellan eingedeckte Schnitte mit Trockenobjektiven, wo also die Dicke des Präparates eine Rolle spielt, angesehen und danach mit Ölimmersion wo die Dicke weniger wichtig ist. Ich sehe auch bei Histopräparaten die mit zu dickem Entellan eingedeckt wurden eine schlechtere Auflösung im Trockensystem. Das gleiche Phenomen tritt auch mit anderen Eindeckmitteln auf, fällt aber in der Histologie nicht so auf weil die Präparate dicker sind und man öfter kleine Vergrößerungen verwendet. Die Sache mit der Brechzahl, lieber Jürgen, habe ich bisher nicht ins Auge gefasst, ist aber interessant. Ich habe Malinol im Schrank.
Ich bin mit Entellan sehr zufrieden weil es auch schnell trocknet, werde aber vor den nächsten Präparaten eine Probeeindeckung machen. Vielleicht hilft es auch einmal genau einen ml Entellan auszuwiegen um die Dichte zu berechnen. Auf der Flasche steht 1L=0,95kg. Das scheint mir sehr ungenau.

@Jürgen, kann ich Malinol auch mit Xylol verdünnen?

@Helmut
Du hast natürlich Recht, dass ein Apochromat mit NA 1,4 eine viel bessere Auflösung bringt als ein Trockensystem. Ich wäre aber schon zufrieden wenn ich mit Eindeckmittel mit einem Trockensystem die gleiche Auflösung bekomme wie mit Immersionsöl statt des Eindeckmittels, und das ist mit neuem Entellan möglich.

Viele Grüße, Ralf

[Ralf Feller]

Hallo Safari,
im Krankenhaus kommt es sehr darauf an was mikroskopiert wird. In der Histologie und Zytologie sind wir verpflichtet die Präparate und Blöckchen aufzuheben, aber nicht nur die Präparate, sondern auch die Datenausdrucke und Chargendokumentationen von Messgeräten die z.B. eine Hepatitis belegen (spätere Ansprüche z.B. von Transfusionsempfängern und Blutspendern). Die Aufbewahrungspflicht liegt zwischen 10 und 30 Jahren. Blutausstriche, die weniger Gewicht haben, bewahren wir nur 4 Wochen auf, Urinsedimente kann man z,B. nicht aufheben.
Die digitale Dokumentation hilft bei der Befundung z.B. von Leukämierezidiven schon sehr.
Im Übrigen bin ich aber sehr froh auf Präparate zurückgreifen zu können. Da fragt z.B. ein Kollege, ,,bist du sicher dass bei Herrn XY keine Tumorzellen vorhanden sind?" oder ,, hast du die Dysplasie bei Z gesehen?", dann sehe ich lieber nach, denn Seltenheiten in einem großen Präparat sind oft nicht im Bild getroffen. Anders ist es bei den neuen Scannersystemen, die ich aber bis heute nicht ausprobieren konnte. Da soll es möglich sein ein ganzes Präparat zu scannen und später virtuell zu mikroskopieren. Zoomify und Stitching, was wir ja wie Ronald gezeigt hat, selber einfach aufprobieren können, lassen mich vieles hoffen. Aber was wenn die Software nicht mehr vorhanden ist, da gibt es wie ich oft verärgert feststellen muss aus kommerziellen Gründen einen steten Wandel. Trotzdem glaube und hoffe ich, dass das Mikroskop auch in weiterer Zukunft nicht verzichtbar sein wird, egal wie ein Mikroskop dann aussehen wir.

Viele Grüsse, Ralf

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

natürlich kannst Du Malinol mit Xylol verdünnen. Nachteilig sind die verhältnismäßig langen Trocknungszeiten. Dafür verschwinden kleinere Luftblasen beim Trocknen.

DePeX trocknet hingegen schneller als Malinol. Vorteilhaft ist auch, dass Du überschüssiges an den Seiten herausgetretenes DePex leicht mit einer Rasierklinge Folienartig entfernen kannst. Dafür ist das saubere Auflegen von großen Deckgläsern etwas tricky, weil Du Lufteinschlüsse unbedingt vermeiden musst.

Schöne Grüße

Jürgen

p.s:

hier noch höner Artikel von Klaus Henkel zu Einschlussmitteln:

http://www.klaus-henkel.de/balsame.html

[momotaro]

Hallo Ralf,

bin zwar nicht vom Fach, aber sollte man nicht das eingedeckte und das uneingedeckte Präparat mit der Ölimmersion fotografieren, um den Einfluss des Deckglases bzw. des Einschlussmittels zu ermitteln. Man könnte den Ausstrich auch auf dem Deckglas durchführen, um den Einfluss des Einschlussmittels auszuschließen. Ich weiß natürlich nicht ob der Aufwand gerechtfertigt ist.

LG

Helmut

[koestlfr]

Hallo Ralf!

Ich denke, diese Diskussion hatten wir schon ...

Für speziell diese Anwendung wurde doch HISTOKITT entwickelt, das macht, aufgrund seiner geringen Viskosität, hauchdünne Schichten, ist glasklar und trocknet extrem schnell!

Der Name sagt fast alles ...

[Ralf Feller]

Hallo Franz,
danke für den Tipp. Habe gerade mal darüber gelesen und gleich eine Flasche bestellt. Das könnte eine gute Lösung für meine Blut- und Knochenmarkausstriche sein.

Gruß Ralf

[koestlfr]

Hallo Ralf!

Fein, du wirst sehen, dass ist ein bewährtes Eindeckmittel für dünne Schnitte und fluoresziert auch nicht!