Botanik: Testfärbung mit Brilliantkresylblau an Pflanzenschnitten

[Fahrenheit]

Liebe Mikrofreunde,

in Regis Moosthread hat Klaus Herrmann den für mich neuen Farbstoff Brilliantkresylblau (C.I. 51010) zum Anfärben der Hyalinzellen vorgestellt.

Angeregt durch Rolf-Dieter Müller habe ich heute erste Versuche mit Schnitten vom Ginkgoblattstiel und dem Blütenstängel einer Orchideenhybriden gemacht, um zu schauen, ob eine selektive Färbung auftritt.

Brilliantkresylblau gehört zu den Diaminobenzooxazinen. Es bilden in wässriger Lösung aktive Farbstoffanteile mit positiver Ladung (über einen Stickstoffkomplex) und färbt Zellbestandteile, die negative Ladung tragen, bläulich an. Um es vorweg zu nehmen: dies ist bei lignifizierten Geweben der Fall, wie anhand der Färbung der Hyalinzellen zu erwarten war. Es liegt also eine selektive Färbung vor.
Der Farbstoff ist für Vitalfärbungen geeignet und wird hauptsächlich zur Untersuchung zoologischer Objekte verwendet.  

Zur Präparation:
- Nutzung vorhandener Handschnitte vom Ginkgoblattstiel (ca. 80 µm) und von
  Mikrotomschnitten des Blütenstängels einer Orchideenhybriden
  (Phalaenopsis, ca. 60 µm).
- Färben mit wässriger Brilliantkresylblaulösung (0,025%, kalt) für 10 und 90 Minuten,
 dazu wurde die 0,25%ige Stammlösung noch einmal um den Faktor 10 verdünnt.
- Beobachtung in Wasser

Zur Technik:
- Leica DM E mit C-Plan Objektiven (Vergrößerung siehe Bildbeschreibung)
- Canon A520 an Leica Periplan mit dem Herrmannschen Adapter
- Stacken mit Zerene Stacker (Build 07.2009)
- Bildbearbeitung mit XNView (Korrektur des Schwarz- und Weisspunkts,  
 Größe angepasst und leicht nachgeschärft)

Bild 1: Leitbündel im Ginkgoblattstiel quer nach 10 min Aufenthalt in der Färbelösung  (Vergrößerung 200x, Stack aus 14 Bildern)

Es werden im Wesentlichen nur die verholzten Zellen angefärbt. Wie bei der Färbung mit den Etzold-Farbstoffen sind einige Zellinnenräume des ungebleichten Schnittes komplett gefärbt.

Bild 2: Leitbündel im Ginkgoblattstiel quer nach 90 min Aufenthalt in der Färbelösung (Vergrößerung 200x, Stack aus 12 Bildern)

Wie man sieht, führt der längere Aufenthalt in der Färbelösung zu einer intensiveren Anfärbung der verholzten Gewebe, ohne die nicht verholzten Zellen weiter anzufärben.

Bild 3: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden, wieder mit einer Färbedauer von 10 Minuten (Vergrößerung 400x, Stack aus 6 Bildern)

Interessant ist hier die große Zelle in der Bildmitte mit der im Vergleich zu den umgebenden Zellen verdickten Zellwand.

Bild 4: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden ebenfalls mit einer Färbedauer von 10 Minuten (Vergrößerung 400x, Stack aus 6 Bildern, Ausschnittsvergrößerung von Bild 3)

In der Ausschnitsvergrößerung (Originalauflösung) sieht man den geschichteten Aufbau der Zellwand.

Bild 5: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden zum Vergleich gefärbt mit Etzold FCA (Vergrößerung 400x, Stack aus 12 Bildern, Dauerpräparat mit Euparal)

Hier zum Vergleich ein anderer Schnitt des gleichen Stängels, der mit Etzold FCA gefärbt ist. Auch dort findet sich (wieder mittig) der Zelltyp mit den verdickten Zellwänden. Allerdings sind diese nur ganz leicht blau gefärbt.

Bild 6: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden zum Vergleich gefärbt mit Etzold FCA (Vergrößerung 400x, Stack aus 12 Bildern, Dauerpräparat mit Euparal, Ausschnittsvergrößerung von Bild 5)

Und wieder die Ausschnittsvergrößerung in Originalauflösung vom Vergleichspräparat.

Leider kann ich nicht sagen, um was für einen Zelltyp es sich hier handelt. Vielleicht kann ja ein in Pflanzenanatomie besser bewanderter Mitleser hier aushelfen?
Auf alle Fälle zeigt die Färbung mit Brilliantkresylblau die interessante Struktur der Zellwände deutlich besser, als die Etzold FCA Färbung (und auch besser als die hier nicht gezeigte Färbung mit Etzold Grün).

Auf die Schnelle habe ich von den Ginkgoschnitten noch ein Dauerpräparat mit dem Einschlußmittel Euparal erstellt, das nun trocknen muss.
Beim Entwässern in Isopropanol erwies sich die Färbung mit Brilliantkresylblau als sehr empfindlich, der Farbstoff wird sehr schnell ausgezogen, solange noch Wasseranteile im Alkohol sind.
Dabei ist auch die Färbung der Zellwände aus den Bildern 3 und 4 verloren gegangen. Hier bleibt also noch einiges zu tun.

Schöne Grüße
Jörg

[Jan Kros]

Hallo Jörg,

Schöne Bilder sind das geworden mit diesem Färbung.
Was mich interessiert ist warum hast Du die Bilder gestackt war das notwendig?
Stäcken bei Insekten kan ich mir vorstellen aber bei schöne Pflanzenschnitten braucht man das doch nicht oder?

Ich höre gerne etwas von Dir.
Herzlichen Gruss aus den Niederlanden
Jan

[Fahrenheit]

Hallo Jan,

danke für Dein Lob!

Das Stacken war leider notwendig  . Meine Schnitte sind nicht so plan, wie ich sie gerne hätte und auch noch etwas dick - da muss ich noch üben.

Und diese speziellen Schnitte sind zudem schon etwas älter (der Ginkgo liegt seit gut 10 Tagen auf Ethanol, der Orchideenstängel seit gut 5 Monaten). Da wird sich vielleicht noch das eine oder andere verzogen haben.

Für eine erste Testfärbung, von der ich ein so vorzeigbares Ergebnis nicht erwartet hatte, wollte ich aber keine frischen Schnitte machen sondern war ganz froh, altes Material sinnvoll verwerten zu können.

Wenn es Dich interessiert, kann ich gerne mal das erste und das letzte Bild einer Serie einstellen. Dann bekommst Du einen guten Eindruck von den Schärfeebenen im Schnitt.

Bei den Aufnahmen der verdickten Zellwände zeigt das gestackte Bild jenseits von irgenwelchen Unebenheiten das feine Linienmuster einfach besser. Das kommt auf den auch scharfen Einzelbildern nicht so schön rüber.
Hier könnte es sich vielleicht um Beugungseffekte handeln, andererseits erinnert die Struktur an den Aufbau angeschnittener Astrosklereiden z.B. aus Schirmtannennadeln.

Herzliche Grüße
Jörg

[Klaus Herrmann]

Lieber Jörg,

also "vorzeigbar" ist untertrieben, das ist sehr schön! Was mir auch gefällt: Deine zusätzliche Recherche.

Was mich verwundert ist Deine Beobachtung, dass der Farbstoff schnell wieder ausgezogen wird, wenn er mit wasserhaltigem Isopropanol behandelt wird.

Das Moos hat die Farbe in 70%igem Ethanol auch nach längerer Zeit nicht abgegeben. Obs am Moos liegt, oder wirkt Ethanol anders wie Isoprop. Kann ich mir nicht vorstellen!

Gibt auf jeden Fall noch was zu tun und es ist super, dass Du durch Deine Untersuchungen den Anstoß dazu gegeben hast.

Gespannt bin ich auch auf Ergebnisse von Herrn Kaiser.

Diese Schichtung in Skerenchymzellen habe ich bei der Brennessel (2 jähriger Spross) auch schon beobachtet (hier Etzoldfärbung!)

Ich sehe gerade, hab beim Suchen ein bescheidenes Bild gefunden - vielleicht finde ich noch ein besseres!

[Fahrenheit]

Lieber Klaus,

vielen Dank für die Blumen!

Das Ausziehen der Farbe muss ich auf jeden Fall noch mal beobachten. Die Schnitte aus der 10 Minuten Färbung hatte ich gut über eine Stunde in einer vergleichsweise großen Menge Isopropanol. Danach waren nur noch die verholzten Zellen gefärbt.
Auch die speziellen Parenchymzellen mit den verdickten Wänden waren da wieder farblos, was gegen eine Sklerifizierung spricht. Es scheint so, als ob im Restwasser verbliebene negative Ionen des Farbstoffsalzes vielleicht gerade durch die Anwesenheit der neutralen Isopropanolmoleküle in der Lage sind, den Farbstoff wieder an sich zu reißen.
Das würde bedeuten, dass eine eingeschobene Spülung mit Aqua dest. das Ausbluten aufgrund der dadurch erfolgten Verdünnung abschwächen oder verhindern könnte.

Die länger gefärbten Schnitte hatte ich gemäß den Rezepten zum Entwässern vor dem Einschluß in Euparal im Isopropanol. Also 30 Sekunden und dann zwei mal 3 Minuten jeweils im frischem Ansatz. Auch da war der Effekt schon deutlich zu sehen. Zunächst verschwindet die Farbe aus den komplett gefluteten Zellen. Ggf. ist dies also  ein positives Verhalten.

Offen ist die Frage, um was für eine Zellart es sich bei den 'Dickwandern'  handelt, da sie sich ja doch recht deutlich von den umgebenden Zellen unterscheidet. Solche Strukturen scheinen jedenfalls recht weit verbreitet zu sein. Du hast Sie in Deinen Brennnesselschnitten gefunden und im Ginkgo habe ich sie gerade beim runterscrollen auch entdeckt: Bild 2 am unteren Rand, etwa über dem Wort "Aufenthalt".

Schön wäre es natürlich, nun eine verträgliche Konterfärbung zu finden, die die nicht verholzten Zellteile anfärbt.

Es bleibt also spannend!  

Herzliche Grüße
Jörg    

[Klaus Herrmann]

Lieber Jörg,

diese Färbung könnte doch Etzold sein in der Astrablau durch Brilliantkresylblau ersetzt wird. Also Mit B. färben und  anschließend mit Fuchsin/Chrysoidin gegenfärben.

Wäre zu testen.

[Rolf-Dieter Müller]

So wie ich Jörg verstanden habe, wird jetzt eine Gegenfärbung für unverholzte Zellwände gesucht.

Einmal könnte man Alciangrün nehmen. Ich fürchte nur, das der Farbkontrast zum Brilliantkresylblau zwar gegeben ist, aber nicht so eindeutig wie es zu wünschen wäre. Alciangrün färbt ja unverholzte Zellwände grün, aber auch teilweise differenzierend nach blau.

Aber ich denke, wir finden hier eine andere Lösung, denn wir sollten, um den prinzipiellen Ansatz von Klaus aufzunehmen, nach einer Rotfärbung suchen.

Aus dem Zimmermann-Schneider *) hätte ich folgende Vorschläge für die Anfärbung von unverholzten Zellwänden:

• Rutheniumrot färbt tief weinrot,
• Kongorot färbt rot,
• Eosin färbt rot.

Jörg, mir scheint in Nelkenöl gelöstes Eosin besonders erfolgversprechend zu sein. Also, Vorfärbung mit Brilliantkresylblau und Nachfärbung mit Eosin. Ich würde analog zu der im Zimmermann beschriebenen Zyanin/Eosin-Färbung eine Differenzierung des Brillisntkresylblaus durch Nelkenöl erwarten.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

*) Zimmermann-Schneider, Bot. Mikrotechnik. 2. Aufl.

[Fahrenheit]

Guten Morgen Rolf-Dieter,

na das passt ja gut. Eosin habe ich da und Nelkenöl war soweit ich mich erinnere in des Professors Kiste. 

Vielleicht könntest Du einmal schauen, ob das stimmt und das Öl noch brauchbar ist. Dann müssten wir uns mal über den Färbevorgang unterhalten. Ich vermute, vor und zwischen der Nelkenöl-Eosin Färbung und dem Überführen in Isopropanol zum Einschluss in Euparal ist je ein Zwischenschritt nötig?

Da das Brilliantkresylblau einen sehr intensiven Blauton ergibt, könnte auch die Färbung mit Rutheniumrot - zumindest aus ästhetischen Gesichtspunkten - interessant sein.

Ich fülle Dir schon mal was von meiner BKB-Stammlösung ab. 

Herzliche Grüße
Jörg

[Rolf-Dieter Müller]

...
na das passt ja gut. Eosin habe ich da und Nelkenöl war soweit ich mich erinnere in des Professors Kiste. 

Vielleicht könntest Du einmal schauen, ob das stimmt und das Öl noch brauchbar ist. Dann müssten wir uns mal über den Färbevorgang unterhalten. Ich vermute, vor und zwischen der Nelkenöl-Eosin Färbung und dem Überführen in Isopropanol zum Einschluss in Euparal ist je ein Zwischenschritt nötig?

Da das Brilliantkresylblau einen sehr intensiven Blauton ergibt, könnte auch die Färbung mit Rutheniumrot - zumindest aus ästhetischen Gesichtspunkten - interessant sein.

Ich fülle Dir schon mal was von meiner BKB-Stammlösung ab. 
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Jörg, Du hast ja recht, die Kiste vom Professor gibt einiges her. Am Wochenende werde ich mal nach Nelkenöl suchen und einen Entwurf eines Arbeitsplans für die Zweifachfärbung Brilliantkresylblau/Eosin erstellen.

Mich hatte schon immer die im Zimmermann beschriebene Färbung Zyanin/Eosin interessiert. Nur fehlte mir ein zeitgemässer Ersatz-Farbstoff für Zyanin. Ich vermute mal, das Du vielleicht dieses mit Brilliantkresylblau gefunden hast.

Anfang nächster Woche bringe ich Dir dann das Nelkenöl zum Tausch vorbei.

Die Färbung mit Rutheniumrot kann ich gerne machen, denn davon habe ich noch etwas. Es ist zwar für eine geplante Edelmetallsalzfärbung bei Pflanzenschnitten vorgesehen, doch es färbt so intensiv, das ich mit guten Gewissen etwas für eine Brilliantkresylblau/Rutheniumrot-Färbung abzweigen kann.

Gruß
Rolf-Dieter

[Klaus Herrmann]

Hallo Rolf-Dieter,

das Rutheniumrot hat den Nachteil, dass es in Lösung leider nicht sehr stabil ist, wie ich mich selbst schon überzeugen konnte. Und es zählt zu den teuren Farbstoffen!

Wie es mit der Haltbarkeit im Dauerpräparat aussieht weiß ich nicht.

[Rolf-Dieter Müller]

...
das Rutheniumrot hat den Nachteil, dass es in Lösung leider nicht sehr stabil ist, wie ich mich selbst schon überzeugen konnte. Und es zählt zu den teuren Farbstoffen!

Wie es mit der Haltbarkeit im Dauerpräparat aussieht weiß ich nicht.

Lieber Klaus,

Du hast natürlich mit Deinen Anmerkungen vollkommen recht und ich werde besonders Dein Hinweis zur Instabilität der Farblösung berücksichtigen. Hinsichtlich der Haltbarkeit in Dauerpräparate werde ich wohl ein Risiko eingehen und es über die Zeit beobachten müssen.

Es ist tatsächlich ein hohes finanzielles Risiko. Rutheniumrot hat eben als Edelmetallsalz seinen Preis. Doch wenn es der Sache dient, kann man es mal versuchen.

Gruß
Rolf-Dieter

[Fahrenheit]

Hallo Klaus,

Du hattest in Regis Moosthread ja geschrieben, dass Du zwei mit Brilliantkresylblau eingefärbte Moospräparate in Euparal eingedeckt hast.

Kannst Du schon was zur Stabilität der Färbung sagen? Ich habe nämlich das Gefühl, dass meine eingedeckten Ginkgo-Schnitte langsam an Farbintensität verlieren.

Mit dem von mir verwendeten Rezept (Vorgehensweise bei der Färbung analog Etzold-Farbstoffgemische) scheint das BKB nicht stabil zu sein.

Herzliche Grüße
Jörg

[Bernhard Kaiser]

Hallo, guten Morgen,

mehrmalige Färbeversuche von Torfmoosen mit Brilliantkresylblau haben tatsächlich ergeben, daß der Farbstoff nach dem Eintrocknen des Präparates weder mit Äthanol noch mit Isopropanol ausgezogen wird.

Vorgang:
Auf dem OT wird in einem Tropfen dem. H2O ein Körnchen BKB völlig aufgelöst und in der Lösung die zu untersuchenden Objekte eingelegt (vor allem Stengel - und Astblätter). Deckglas auflegen und beobachten.
Nach dem völligen Eintrocknen, die 4 Ecken mit Nagellack festlegen.

Will man das Präparat wieder anschauen, einen Tropfen Äthanol zugeben, um die Luftblasen aus den Zellen zu vertreiben, dann einen Tropfen dem. H2O.

Die Färbung hält nach der Alkoholzugabe. Methylenblaufärbung wird ausgezogen. Allerdings ist die Blaufärbung mit BKB nicht so leuchtend wie MB.

Freundliche Grüße
Bernhard Kaiser

[***]

Beitragsinhalt auf Wunsch des Autors gelöscht

[Klaus Herrmann]

Hallo Mike,

Was mich nur gewundert hat ist, das die Skerenchymzellen sich blau färben.

Die Sklerenchymzellen sind dann nicht lignifiziert, sondern bestehen nur aus Cellulose. Dann werden sie nicht vom Fuchsin/Chrysoidin angefärbt.
Ich wollte sowieso noch einen Cellulosenachweis machen um diese Hypothese zu untermauern.

# Jörg, danke für Deine weiter führenden Untersuchungen. Ich habe 5 Jahre alte Präparate Epidermis des Tulpenblattes gefärbt mit B; die sind wie damals (Eindeckmittel Euparal).

# Herr Kaiser, vielen Dank für Ihre Untersuchungsergebnisse, die sich mit meinen decken! Jetzt müssen wir nur noch herausfinden, ob es gewebespezifische Unterschiede gibt, die dafür sorgen, dass es einmal dauerhaft aufzieht und einmal nicht. Was ja durchaus wahrscheinlich ist!

Wie Jörg schon sagte: es bleibt spannend!