Vitalfärbung von Bauchhärlingen mit Neutralrot

[Michael]

Hallo in die Runde,

im Forum wurde bereits die Vitalfärbung von Rädertieren mit dem Farbstoff Neutralrot von Michael Plewka vorgestellt (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=21373.0). Da ich im Internet und in der Literatur keine Beispiele für eine entsprechende Färbung bei Gastrotrichen gefunden habe, wollte ich diese Färbung selbst ausprobieren.
Anders als bei der bekannten Färbung der Vakuolen in Pflanzenzellen ist es bei Tieren nötig, die Farbstoffkonzentration stark zu reduzieren. So wird z.B. für Kaulquappen im Romeis eine Neutralrot-Konzentration von 1:200 000 und eine Färbedauer von einigen Tagen angegeben. Durch diese nahezu "homöopathische" Konzentration überleben die Tiere die Färbung und der Farbstoff wird durch die biologische Mechanismen (z.B. Stoffwechsel) selektiv in den Zellen und Organen der Tiere angereichert. Dabei zeigen sich die Unterschiede in den verschiedenen Zelltypen und es kommt (bei Gastrotrichen und den zufällig mitgefärbten Rädertieren) meist zu einer "elektiven Färbung", d. h. einzelne Organe werden besser gefärbt als andere, die ggf. ungefärbt bleiben.
Um die niedrige Farbstoffkonzentration zu gewährleisten, gebe ich einen Tropfen Neutralrot-Stammlösung (ca. 0,1%) auf das Deckglas und wische den Farbstoff nach einigen Minuten wieder gründlich ab. Die geringen - unsichtbaren -  Farbstoffreste genügen bereits um eine Vitalfärbung durchzuführen. Das Deckglas umrande ich dann mit Vaseline, so dass das Präparat nicht austrocknet und die nötige Färbedauer erreicht werden kann. Als Proben habe ich einen kleinen Tropfen Detritus aus einem Gartenteich verwendet, der meist einige Bauchhärlinge enthält.


Bild 1: Ch. elegans; Vitalfärbung mit Neutralrot nach ca. 2 Tage Färbedauer

Bereits einige Stunden zeigen sich die ersten Verfärbungen. Nach ca. zwei Tagen ist die Färbung bereits sehr deutlich. Wie bei allen Färbungen ist die Identifikation der gefärbten Teile nur durch den Vergleich mit anderen Erkenntnissen möglich.
Bei Gastrotrichen wird der Darm und die Darmzellen diffus gefärbt. Hier ist die Färbung sehr deutlich. Die anderen, diskret gefärbten Stellen sind durch den Vergleich mit anderen Kernfärbungen als Zellkerne identifizierbar. Auffallend ist, dass die Kerne der Gehirnzellen nicht oder nur sehr schwach gefärbt werden.


Bild 2: Ch. elegans; Vitalfärbung mit Neutralrot nach ca. 2 Tage Färbedauer; Detail

Bei Vitalfärbungen ist die Interpretation der Ferbeergebnisse immer sehr schwierig, da der Färbeprozess von den biologischen Abläufen in den Zellen abhängt. Der Farbstoffeintrag in eine Zelle ist abhängig von den Diffusionsprozessen. Dem gegenüber stehen Prozesse der Zellreinigung, die den Farbstoff wiederum aus der Zelle entfernen und mit der Stoffwechelaktivität der Zelle anwachsen. Der in der Zelle verbleibende "basische" Farbstoff wird dann bevorzugt an "saure" Zellbestandteile, z.B. den Zellkern, angelagert. Die tiefrote Farbe von Neutralrot wiederum spricht für einen niedrigen pH-Wert der gefärbten Zellbestandteile (Neutralrot ist ein Indikatorfarbstoff).
Offensichtlich ist der Darminhalt mit sauren Verdauungssekreten gefüllt. Diese Sekrete finden sich auch in den Darmzellen (wahrscheinlich werden die Sekrete von ihnen produziert). Das Lumen des Saugmagens enthällt offensichtlich kein Verdauungssekret, da es vollkommen ungefärbt bleibt. Die Drüsen, die in den Pharynx münden, werden ebenfalls nicht speziell gefärbt und tragen wohl nicht zu der Verdauung bei.
Das Gehirn bleibt weitgehend ungefärbt. Möglicherweise ist hier die Soffwechseltätigkeit besonders hoch. Lediglich die Zellkerne der Sinneszellen, in die direkt die Tasthaare münden, werden gut gefärbt. Möglicherweise liegt das an dem hohen Farbstoffeintrag durch die direkten Verbindung zur Umgebung.


Bild 3: Heterolepidoderma sp., juvenil ; Auflösung der Schuppen durch Neutralrot

Eine Neutralrotfärbung ist nicht bei allen Gastrotrichenarten anwendbar. Neutralrot scheint die Schuppen der Tiere aufzulösen, so dass empfindlichere Tiere (Bild 3) innerhalb kurzer Zeit "nackt" erscheinen. Das gezeigte Tier überlebte das Schlüpfen nur um einige Stunden.


Bild 4: Ch. elegans; Endstadium der Vitalfärbung mit Neutralrot nach ca. 6 Tage Färbedauer

Nach einigen Tagen Färbedauer stellt sich ein Gleichgewicht ein und die Färbung wird nicht mehr intensiver (Bild 4). Ich konnte das gefärbte Tier über ca. 10 Tage beobachten, bis es verstarb. In dieser Zeit konnte ich keine Kernteilungen oder Verlagerungen der Zellkerne feststellen. Dieser Befund ist konsistent mit der Zellkonstanz der Gastrotrichen. Auffallend war, das das beobachtete Tier, obwohl in der langen Beobachtungszeit eigentlich zu erwarten, kein Ei entwickelt hat. Offensichtlich läuft auch eine "Vitalfärbung" nicht ohne Schädigungen ab.


Schöne Feiertage und ein gutes neues Jahr

Michael

[limno]

Hallo Michael,
die Konzentration, du verwendest, ist viel zu hoch! Bei Paramecien z.B. verwende ich Konzentrationen von 1:10000, und das nicht im Langzeitversuch. Ich bin überzeugt, dass  die im Romeis empfohlene Konzentration schon die richtige Richtung vorgibt, so dass Schäden vermieden werden können, denn das Wohlergehen Deiner Bauchhärlinge liegt auch mir am Herzen. Ich freue und wundere mich, dass Du bei Deinen Fängen in puncto Bauchhärlingen erfolgreich bist. Bei mir sind sie zwar dabei, aber doch in recht geringer Zahl. Meine Massenkulturversuche sind bislang.nicht von Erfolg gekrönt.
Einen guten Rutsch wünscht
Heinrich

[Dieter Stoffels]

Lieber Michael,

vielen Dank für das Einstellen dieses Beitrages!

Einen solchen Versuch durchzuführen und die Ergebnisse zu beschreiben, ist sicher viel Arbeit. Ich habe Deinen Beitrag aufmerksam gelesen und würde Dich gerne bitten, mir einmal den vollständigen Gattungsnahmen des Tieres zu nennen. Das Neutralrot zeigt ja einen Farbwechsel im Bereich zwischen 6,8 bis 8,0 von rot nach gelb. Im alkalischen Bereich liegt Neutralrot ungelöst, im sauren als positiv geladene, kationische Verbindung vor, die nicht mehr in der Lage ist, die Zellmembran von innen nach außen zu passieren. Bei deinem Tier ist der Pharynx nicht, aber der Magendarmbereich rot angefärbt worden, was auf einen sauren pH-Wert des "Magensaftes" schließen lässt. Des Weiteren scheinen sich drüsige Strukturen über den gesamten Magendarmabschnitt zwischen Darm und Epidermis angefärbt zu haben. Als mögliche Strukturen kämen hier gattungsabhängig Protonephridien oder "sub"epidermal gelegen Klebdrüsen in Frage? Bei den Evertebraten bestehen die Drüsen ja in der Regel aus nur einer Zelle mit einem langen Ausführgang, was aber nicht bedeutet, dass sich Drüsenendstücke zusammenlagern können. In deinen Aufnahmen sind im Zwischenbereich von Magendarm und Epidermis rot gefärbte, traubige Strukturen zu erkennen, bei denen es sich um solche Drüsen handeln könnten.

Die Epidermis ist meist zellulär oder syncytial angelegt, zu Teilen bewimpert und an ihrer Oberfläche mit einer Cuticula sowie mit deren Sonderbildungen (Hartgebilde in Form von Schuppen, Platten usw., Panzer) belegt. Dass sich diese Strukturen von der Oberfläche der Epidermis abgelöst haben, ist für mich nachvollziehbar, ich bezweifle aber, dass sich das cuticuläre Material in Wasser aufgelöst hat.

Nochmals vielen Dank für das Einstellen dieses Beitrages!

Dieter

[Jürgen Boschert]

Hallo Michael,

toller Beitrag.

... Das Gehirn bleibt weitgehend ungefärbt. Möglicherweise ist hier die Soffwechseltätigkeit besonders hoch. ...

Könnte es nicht auch sein, dass schon bei diesen  Winzlingen die Strukturen einer Blut-Hirn-Schranke ausgebildet sind ?

Gruß und einen Guten Rutsch !

JB

[Michael]

Hallo,
vielen Dank für Euer Interesse und den vielen Nachfragen.

@Heinrich:
Du hast natürlich Recht - die Konzentration der Stammlösung von 1:1000 wäre zu groß. Deshalb gebe ich nur einen Tropfen aufs Deckglas und wische die Stammlösung dann gründlich wieder ab. Dadurch bleiben nur Spuren des Farbstoffes auf dem Deckglas und gelangen so in das Präparat. Wie groß die Endkonzentration dann ist, kann man bei so einem "Freihandvorgehen" natürlich nicht sagen, aber sie wird einige Größenordnungen kleiner sein als die der Stammlösung.  Man muss hier ein bisschen Ausprobieren, bis man eine für sein Zielobjekt verträgliche Konzentration erhält. Weniger ist aber auf alle Fälle mehr!

@Dieter
Bei den Tier handelt es sich um Chaetonotus elegans. Die Art habe ich im Sommer bei einigen seiner Artgenossen - inklusive Schuppenanalyse  - bestimmt. Wenn ich nicht mehrere sehr ähnliche Arten (die es leider gibt) in meinem Gartenteich habe, sollte die Artdiagnose korrekt sein. Für das Thema des Beitrags ist aber die genaue Gastrotrichenart wohl nicht wichtig.
Aufgrund der Indikatoreigenschaft von Neutralrot gehe ich auch davon aus, dass der Darminhalt durch einen sauren "Magensaft" gefärbt wurde - ein direkter Nachweis, den ich so bei Gastrotrichen noch nicht gelesen habe. Die Darmwand besteht nur aus sehr wenigen (ca. 25) recht großen Zellen, die ebenfalls gefärbt wurden und den "Magensaft" wohl produzieren. Zwischen Darm und Epidermis liegen nur noch einige Muskel- und Nervenfasern, deren Zellkerne gefärbt wurden. Die beiden einzelligen Protonephridien liegen ebenfalls in diesem Bereich, können aber von mir im freischwimmendem Tier nicht identifiziert werden (dazu wäre ein Festlegen und leichtes Quetschen nötig). An Drüsen sind in Süßwassergastrotrichen nur die Klebedrüsen an der Zehenbasis und einige "Speicheldrüsen", die in den Pharynx entleeren, bekannt. Die Zellkerne der dreizelligen Klebedrüsen sind im Detailfoto Bild 2 erkennbar. Die Zellen selbst bleiben - wie auch die "Speicheldrüsen" - ungefärbt.
Das Verhalten der Schuppen hat mich selbst überrascht. Prinzipiell ist es so, dass die Schuppen säureresistent sind, sich aber im alkalische Milieu auflösen. Ich glaube aber, dass sich durch die geringe Farbstoffkonzentration keine große pH-Verschiebung ergeben kann. Dennoch konnte ich über einige Stunden die Auflösung der Schuppen live beobachten. Ich glaube nicht, dass ein einfaches Ablösen der Schuppen von mir nicht bemerkt wurde. Jedenfalls würden sich Versuche in dieser Richtung lohnen.

@Jürgen:
"Blut-Hirn-Schranke" wäre sicherlich der falsche Ausdruck, da kein Blut vorhanden ist. Dennoch erscheint es offensichtlich, dass die Schadstoffkonzentration (Farbstoff) im Gehirn geringer war als im Rest des Körpers. Es sind gerade diese Befunde, die eine Lebendfärbung, die ja die dynamischen Vorgänge in den lebenden Zellen abbildet, so spannend machen. Im fixierten Tier dringt der Farbstoff problemlos in die Gehirnzellen ein:


Zellkerne der Gehirnzellen bei Ch. maximus; gefärbt mit Methylgrün, unterschiedliche Fokusebenen

Deshalb glaube ich, dass die "Zellreinigung" bei den lebenden Gehirnzellen den Farbstoff sehr effizient aus den Zellen schafft - effizienter als bei den anderen Zelltypen.

@Thilo:
Klassisch gab es einige Vitalfärbungen, die aber inzwischen alle durch die modernen und selektiveren Fluoreszenzmethoden abgelöst wurden und wohl nur noch von uns Amateuren verwendet werden. Dennoch bleiben wohl alle Vitalfärbungen, die ja gerade die Dynamik in der Zelle abbilden, schwer interpretierbar.  Aber das macht ja gerade den Reiz aus!

Viele Grüße

Michael

[Dieter Stoffels]

Lieber  Michael,

vielen Dank für Deine ausführliche Antwort.

Ein schöner Versuch, nochmals vielen Dank für das Einstellen!

Dieter

[Michael Plewka]

hallo Michael,

ich schließe mich den anderen ,,Vorrednern" an: ,,Hut ab" vor diesem Langzeitversuch und vielen Dank  für den Erfahrungsbericht.

Nun ist es allerdings so, dass Neutralrot als Färbemittel wesentlich komplexer in seinen Eigenschaften ist als andere Farbstoffe.

Dieter S. hat es schon angedeutet, und ich will es hier nochmal deutlich herausstellen: es gibt einen -mittlerweile als klassisch zu bezeichnenden- Schulversuch zum Thema ,,Ionenfalle" mit Neutralrot, der auf den zwei wesentlichen  chemischen Eigenschaft des Neutralrots basiert, nämlich

1.   pH-abhängig die Farbe zu verändern

und

2.   pH-abhängig seine Permeabilität zu ändern. Das bedeutet, ergänzend zu dem, was Dieter S. bereits geschrieben hat, dass die Neutralrot-Moleküle bei einem pH-Wert < 7,5 nicht nur nicht aus der Zelle heraus-, sondern auch nicht  in  Zelle hineinkommen. Wasser kann durchaus einen pH- Wert in diesem Bereich haben. Man sollte also zumindest sich dessen bewusst sein, mit welchem Wasser man die Neutralrotlösung ansetzt bzw. den pH-Wert kennen bzw. angeben!

Daraus ergeben sich  einige kritische Anmerkungen zu der Methode bzw. zu der Interpretation der Beobachtungen:

.... Dem gegenüber stehen Prozesse der Zellreinigung, die den Farbstoff wiederum aus der Zelle entfernen und mit der Stoffwechelaktivität der Zelle anwachsen. Der in der Zelle verbleibende "basische" Farbstoff wird dann bevorzugt an "saure" Zellbestandteile, z.B. den Zellkern, angelagert. Die tiefrote Farbe von Neutralrot wiederum spricht für einen niedrigen pH-Wert der gefärbten Zellbestandteile (Neutralrot ist ein Indikatorfarbstoff).

und:

...Deshalb glaube ich, dass die "Zellreinigung" bei den lebenden Gehirnzellen den Farbstoff sehr effizient aus den Zellen schafft - effizienter als bei den anderen Zelltypen.

1.  Die (tief)rote Farbe beim Neutralrot  bedeutet  nicht notwendigerweise, dass ein niedriger pH-Wert vorliegt:  die Umgebung   kann auch neutral (bzw. lediglich schwach sauer) sein. Die Begriffe ,,basisch" und ,,sauer" haben in diesem Fall nichts mit dem (absoluten) pH-Wert zu tun und sind insofern in diesem Zusammenhang (pH-Wert und Farbe) eher verwirrend.
Was die ,,Tiefe" der Farbe angeht, so ist das natürlich eine Sache der Konzentration: der Farbstoff bindet an bestimmte Moleküle und liegt dort in erhöhter Konzentration vor. 

2.   Nach den zuvor darstellten, vom  pH-Wert abhängigen,  Permeabilitäts-Eigenschaften des Neutralrots ist genausogut bzw. noch eher anzunehmen, dass die Farbstoff-Moleküle garnicht in die Zellen des Gehirns eindringen.   Insofern war die Idee von Jürgen Boschert mit (den Strukturen) einer Blut-Hirnschranke (unter der Voraussetzung, man interpretiert diese als eine Permeabilitätsbarriere) gar nicht so abwegig.    Alternativ  kann man annehmen, dass ein pH > 7,5 in diesen Zellen vorliegt, so dass der Farbstoff gelb erscheint und deshalb nicht auffällt. Und letzlich kann es sein, dass die nicht gefärbten Zellen keine anfärbbaren Molküle enthalten.

Es gibt also durchaus (noch nicht widerlegte) Alternativen zu der ,,Zellreinigungs"-Hypothese.

Dann sind da noch zwei Fragen:

1.   Du schreibst im Zusammenhang mit der Permeabilität des Neutralrots:

....Im fixierten Tier dringt der Farbstoff problemlos in die Gehirnzellen ein

wenn ich das richtig verstehe, ist das Viech in dem Foto   aber  mit  einem anderen Farbtoff, nämlich Methylgrün gefärbt. Deshalb: dringt Methylgrün in nicht fixierte Viecher nicht ein? Bzw. hast Du diesen Versuch mal mit Neutralrot durchgeführt? Das würde den Ausschluss einiger der o.a. Alternativen möglich machen.

2.   Du vergleichst bezüglich des Auflösens der Schuppen der Gastrotrichen zwei Arten in zwei unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Bei der juvenilen Heterolepidoderma  lösen sich die Schuppen auf, bei der anderen Chaetonotus-Art sind die Schuppen aber noch nach mehreren Tagen sichtbar. Ist die Empfindlichkeit der Schuppen art- oder entwicklungsabhängig? Hat Du mal ein juveniles Chatonotus-elegans-Viech dem Neutralrot ausgesetzt?


Beste Grüße
Michael Plewka

[Michael]

Hallo Michael,

vielen Dank für Deine Anmerkungen, die die Komplexität der Vtalfärbung mit Neutralrot aufzeigen.
Das "Umgebungswasser" muss demnach im richtigen pH-Bereich gelegen haben, da sonst der Farbstoff in keine der Zellen eingedrungen wäre. Die interessante Frage ist also, warum sich die Gehirnzellen (bzw. deren Zellkerne) nicht gefärbt haben.
Offensichtlich ist die Farbstoffkonzentration in den Gehirnzellen kleiner als in den übrigen Zellen. Ob der Farbstoff schlechter eindringt oder besser abtransportiert wird, kann so wohl nicht entschieden werden. Wichtiger erscheint mir, dass das Gehirn gegen Schadstoffe besser geschützt erscheint, als der Rest des Tieres.
Du hast natürlich recht - der Färbeversuch mit Methylgrün kann das Eindringen von Neutralrot nicht beweisen. Dennoch ist mir bei meinen Färbeversuchen kein Unterschied in der Färbbarkeit der unterschiedlichen Zelltypen bei fixierten Tieren aufgefallen. Neutralrot mag da natürlich eine Ausnahme darstellen.
Fixierte Tiere habe ich nicht mit Neutralrot gefärbt; bei verstorbenen Tieren fällt aber auf, dass diese sich entfärben. Das mag aber einfach mit der Auflösung der angefärbten Strukturen zu tun haben. Mit (essigsaurem) Methylgrün kann man keine unfixierten Tiere färben, da die Färbelösung fixiert.

Die Auflösung der Schuppen bei Heterolepidoderma wurde nur "so nebenbei" bemerkt, und ist sicherlich genauere Versuche wert. Im Moment kann ich eigentlich nur berichten, dass ich bei Heterolepidoderma sowohl bei ausgewachsenen als auch bei juvenilen Tieren eine fast vollständige Auflösung der Schuppen beobachtet habe. Der gezeigte Ch. elegans ist ebenfalls im Präparat geschlüpft. Im Vergleich zu meinen anderen Beobachtungen dieser Art glaube ich, dass die Schuppen "undeutlicher", also wohl angegriffen sind. Genaueres lässt sich im Moment wohl nicht dazu sagen.

Viele Grüße

Michael Müller