Autor Thema: Wollemie - ein pathologischer Versuch  (Gelesen 3197 mal)

koestlfr

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Wollemie - ein pathologischer Versuch
« am: März 21, 2018, 14:46:41 Nachmittag »
Liebe ForstpathologInnen!

Vorab ein grosses Lob an die Organisatoren und Vortragenden der Kornrade 2018 - tolle Organisation, tolle Beiträge!

Aus dem Lager der Schibbler möchte ich Euch eine Ergänzung zur Kornrade 2018 und zu Jörgs Beitrag über Wollemia nobilis (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?PHPSESSID=20mbkkpv4hslgdo4l64607a302&topic=27181.0) zeigen.

Jörg hat mehrere Pflanzenproben, darunter auch Wollemia nobilis, ausgeteilt, wobei bei meinen Proben der bereits fixierten Blattteile einer mit dunkelbraunen Pusteln war. Jörg hat angeregt, speziell den befallenen Bereich zu schneiden. Die Ergebnisse möchte ich zeigen …

Der Probeschnitt (40µ) war leider im Bereich des Befalls unvollständig, ich habe ihn trotzdem mit W3A gefärbt. Der Schnitt ist im Durchlicht, meiner Meinung nach, nicht aussagekräftig - also Fluoreszenz bei 365nm:

 

Bild 1 Färbung mit W3A
Aufnahmedaten: Olympus BX51, U-PlanSApo 10x, LED 365nm; U-MWU2; Pentax K3.

In der Fluoreszenzaufnahme des mit W3A gefärbten Schnittes kann ich zwar eine Demarkation erkennen, aber ich kann keine Ursache – weder Hyphen noch sonstige Befallsindizien- ausmachen!

Deshalb habe ich den Pflanzenteil mit PEG infiltriert und nach ca. 48h gegen die Beule ziehend (40µ) geschnitten. An den Schnitten habe ich zwei Färbungen versucht:

 

Bild 2 Färbung mit Auramin/Safranin; Aufnahmedaten: wie Bild 1 jedoch mit HBO-Lampe

 

Bild 3 Färbung mit Coriphosphin O/Uvitex 2B; Aufnahmedaten: wie Bild 1 jedoch auch mit HBO-Lampe

Meine Fragen ans Forum:

-   Ist es, so wie ich vermute aber nicht nachweisen kann, ein Pilz?
-   Wie hätte ich vorgehen sollen?
-   Was könnte es sonst sein?
-   Wie könnte ich diesen Schädling nachweisen? Ich habe allerdings kein Frischmaterial.
« Letzte Änderung: März 21, 2018, 15:03:56 Nachmittag von koestlfr »
Liebe Grüße
Franz

reblaus

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #1 am: März 21, 2018, 16:48:35 Nachmittag »
Hallo Franz -

wie sieht denn das gefärbte Präparat in normalem Durchlicht aus, ist die Stelle an welcher die Blaufluoreszenz auftritt gefärbt?
Du hast UV-Fluoreszenz zur Verfügung - das ist günstig, weil du dadurch manche Abwehrstoffe, welche die Pflanze gegen Pilze bildet als Blaufluoreszenz sichtbar machen kannst. werden. In diesem Fall würde aber die Fluoreszenz der W3A-Farbstoffe nur stören. Wenn du also noch ungefärbte Schnitte hast, schau mal ob die blaue Fluoreszenz (ist das die "Demarkationslinie"?) auch ohne Färbung auftritt, dann würde es interessant!

Viele Grüße

Rolf

koestlfr

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #2 am: März 21, 2018, 18:08:17 Nachmittag »
Hallo Rolf!

Herzlichen Dank für die Anregung! Ich habe ein Schnippel mit Wasser eingedeckt und sowohl Hellfeld wie Fluoreszenz bei 365nm mit 20x gemacht:





Die Demarkationslinie ist wieder blau ... die Pflanzenteile sind fixiert!?
Liebe Grüße
Franz

Klaus Herrmann

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #3 am: März 21, 2018, 20:09:55 Nachmittag »
Hallo Franz,

tolle Aufnahmen! Eine Frage Ist das Coryphosphin für rot grün und das Uvitex für blau zuständig?

Hast du eine Beschreibung der Färbung?
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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reblaus

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #4 am: März 21, 2018, 21:32:13 Nachmittag »
Hallo Franz -

die letzten Fotos also von ungefärbtem Material? Dann ist es so wie ich vermutet habe! Es handelt sich um Metaboliten, die von der Pflanzenzelle in die Zellwände eingebaut werden um einen Pilzbefall am Fortschreiten zu hindern. Der Blaufluoreszenz nach könnte es sich um Stilbene handeln. Der Chemismus ist verwandt mit der Ligninsynthese in Holzteilen.
Nach Pilzhyphen brauchst du nicht zu suchen, es ist eine Wissenschaft für sich, solche in abgestorbenem Gewebe sichtbar zu machen.
Lies mal in Wikipedia unter "Stilben" und "Resveratrol" nach. Du musst aber nicht alles glauben, was über dessen wundertätige Wirkung geschrieben wird: Als wir vor 40 Jahre die Resveratrolproduktion in Weinreben nach Pilzbefall bzw. UV-Stress auf einen Kongress zeigten, wurden wir von besorgten Zuhörern gefragt, ob wir das alles auch toxikologisch hätten untersuchen lassen ... Nachdem sich aber herausgestellt hatte, dass Resveratrol besonders in den Beerenschalen der Rotweinsorten vorkommt, wurde das sofort begierig Marketingleuten und Gesundheitsaposteln ohne weitere Bedenken ausgeschlachtet.

Viele Grüße

Rolf

koestlfr

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #5 am: März 22, 2018, 06:29:16 Vormittag »
Hallo Rolf!

Herzlichen Dank für Deine ausführliche Antwort!

Ja, die beiden letzten Bilder sind fixiertes, ungefärbtes Material. Schade, dass die Reste des Pilzes so schwer sichtbar zu machen sind. Das befallene Material wirkt schon wie in Zersetzung begriffen,

Hallo Klaus!

Danke für das Kompliment.

Die Färbung war, so meine ich mich zu erinnern, in einem Büchlein von Reichert über die Fluoreszenzmikroskopie.
« Letzte Änderung: März 22, 2018, 06:37:45 Vormittag von koestlfr »
Liebe Grüße
Franz

anne

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #6 am: März 22, 2018, 08:19:26 Vormittag »
Hallo Franz,
unabhängig vom fachlichen Hintergrund, finde ich das 3.Bild sagenhaft!!

lg
anne
« Letzte Änderung: März 22, 2018, 12:45:55 Nachmittag von anne »

koestlfr

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #7 am: März 22, 2018, 08:44:23 Vormittag »
Hallo Anne,

danke für das Lob!

Die Kombination der Fluoreszenzfarbstoffe ist recht plakativ ...
Liebe Grüße
Franz

Fahrenheit

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #8 am: März 22, 2018, 10:25:11 Vormittag »
Lieber Franz,

Du könntest eine ungefärbten schnitt mit Chloralhydrat bleichen und dan mit Baumwollblau färben.
Da die Hyphen in aller regle nicht so nett sind parallel zur schnittebene zu verlaufen, sollte der schnitt etwas dicker sein - zwischen 100 und 150µ.

Da müsstes Du zumindest am Rand der befallenen Stellen kräftig blau gefärbte Hyphenstückchen finden.

Die Fluoreszenzbilder find eich auch wirklich toll. Fantastische Farben.

Herzliche Grüße
Jörg
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Klaus Herrmann

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #9 am: März 22, 2018, 10:37:53 Vormittag »
Vielen Dank Franz,
unter dem Stichwort habe ich nichts gefunden aber hier eine beschreibung, die mich davon abgehalten hat es auch zu versuchen:

https://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-015-0096-0
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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Horst Wörmann

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #10 am: März 22, 2018, 11:29:20 Vormittag »
Lieber Franz,

Uvitec bei Pilzhyphen ist immer einen Versuch wert!
Entschuldige, wenn ich Deinen Thread kapere, aber hier sind Bilder, die die Uvitex-gefärbten Hyphen meiner Ansicht sehr schön zeigen:

Querschnitt einer Pflanzengalle, einer "Ambrosia-Galle" mit Pilzbewuchs in der Larvenkammer. Rechts Reste der Larve, deren Chitin ebenfalls mit Uvitex angefärbt wird, dann die mit Piklzhyphen durchzogene Innenwand, und anschließend der Gallenkörper.


Deteil der Innenwand: Hyphen nicht eindeutig erkennbar.


Hier dieselbe Stelle im UV bei 365-nm-Anregung:


Paraffineinbettung, Mikrotomschnitte ca. 8 µm, Färbung Uvitex und Eindeckung in DePeX (ist nicht fluoreszierend!).

Viele Grüße
Horst

reblaus

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #11 am: März 22, 2018, 11:40:16 Vormittag »
Hallo Franz -

ich erfreue mich zwar auch immer an der Farbenpracht der Farbstoff-Fluoreszenz bei gefärbten Schnitten, Begeisterung bricht aber - dank meiner déformation professionelle - erst aus, wenn uns die Fluoreszenz zusätzliche Erkenntnisse bringt , und das ist bei Deinen letzten beiden Bildern der Fall! Solch knackige "Auto"fluoreszenz kriegt man selten.
Kannst Du noch nähere Angaben zu den Filtern machen?

Viele Grüße

Rolf


koestlfr

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #12 am: März 22, 2018, 13:54:02 Nachmittag »
Lieber Jörg!

Danke, diesen Versuch kann ich am Wochenende nachliefern - diese Schnittdicke sollte kein Problem darstellen! Ich hoffe ich habe noch genug befallene Stellen.

Hallo Klaus!

Danke für den Link, werde ich studieren ...

Lieber Horst!

Danke für Deine anschauliche Ergänzung!

Ich habe mit Histokitt eingedeckt, das hat auch keine Eigenfluoreszenz, aber manche Farbstoffe gehen geringfügig in Lösung und dann kommt es zu leichten Säumen.

PS: ich sollte für manche Problemstellungen auch mit Paraffin infiltrieren und unter 10µ schneiden.

Hallo Rolf!

Die Diskussionen um Fluoreszenzbilder kenne ich gut, bin aber der Meinung, dass man bei 365nm sehr oft gute zusätzliche "Verdeutlichungen" bekommt.

Der Filterwürfel ist der U-MWU2 von Olympus mit:

Excitation filter   Emission filter   Dichromatic mirror
330-385nm       420nm                   400nm

PS: in dieser Situation ist der Chip der K3 "mit ohne" Tiefpassfilter wirklich auch hilfreich!
« Letzte Änderung: März 22, 2018, 16:14:21 Nachmittag von koestlfr »
Liebe Grüße
Franz

Rolf-Dieter Müller

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #13 am: März 22, 2018, 14:28:04 Nachmittag »
Hallo Franz,

ein spannender Beitrag mit hochinteressanten Erläuterungen, Ergänzungen und sehr schönen Bildern, wobei mich ebenfalls und besonders die Primärfluoreszenz anspricht.

Bisher dachte ich mit Blauanregung auskommen zu können, aber UV-Anregung gibt ja auch einiges her.

Viele Grüße,
Rolf-Dieter

koestlfr

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Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
« Antwort #14 am: März 22, 2018, 15:23:36 Nachmittag »
Hallo Rolf-Dieter!

Danke für das Lob!

Für Autofluoreszenz sollte man unter 400nm gehen, besonders schön bei Lebendschnitten.

Wie könnte es in der Werbung heissen: ist ja nur ein Würfel ... (und ev. eine LED ...)
Liebe Grüße
Franz