Frage zu DAPI

[Frank S.]

Hallo Mikroforum,

ich experimentiere zur Zeit mit dem Farbstoff DAPI zur Auflichtfluoreszenz.
DAPI hat die Eigenschaft sowohl DNA als auch RNA zu markieren und in verschiedenen Wellenbereichen unterschiedlich darzustellen. Das Emissionsmaximum bei RNA liegt bei ca. 500 nm - also im Grünbereich; DNA bei 460 nm - bläulich.
Sollte man für eine eukaryontische Zelle, z. B. Epithelzelle daher nicht immer eine 2 farbige Darstellung der gefärbten Zelle bekommen (Kernbereich mit DNA und ribosomale RNA im Zytoplasma verteilt)? Der RNA-Anteil sollte doch ausreichend hoch sein. Tatsächlich erscheint die gesamte Zelle jeweils in etwa mit dem gleichen bläulichen Farbton in unterschiedlicher Helligkeit.

Gruss
Frank

[Frank S.]

Hallo,
bei der Durchmusterung von mit DAPI gefärbten Bakterienausstrichen (keine Reinkulturen) fallen mir die Farbunterschiede hinsichtlich der verschiedenen Emmisionsspektren auf. Neben der erwarteten blauen Färbung erkennt man hier auch Bakterien welche grünliches Licht emmitieren, was auf RNA Kopplung hinweist.
Wie ist das zu erklären?
Nach meinem Verständnis liegt für die  Bakterienzellen der DNA-Strang über die Zelle verteilt im Zytoplasma. Die Färbung sollte somit doch für alle Bakterienzellen gleich sein!?

Evtl. kennt jemand einen Link zu entsprechenden DAPI-Färbebildern, oder gute Literaturhinweise?

Viele Grüße
Frank

[bewie]

Hallo Frank,

meine Experimente mit DAPI liegen zwar schon Jahrzehnte zurück, aber ich will mal sehen, was mir auf die Schnelle noch einfällt.

DAPI interkaliert, lagert sich also in die DNA-Helix ein (oder besser gesagt in eine der Furchen zwischen den beiden Strängen). Angeblich spielen vor allem AT-Bereiche eine Rolle. Die Bindung steigert die Fluoreszenzintensität um das 20fache. Die Bindung an die immer viel kurzsträngigere RNA ist meines Wissens weit weniger ausgeprägt, zumal die RNA nicht in einer Doppelhelix, sondern in anderer Konformation vorliegt und es in der RNA keine AT-Bereiche gibt. Die Bindung an die AU-Basenpaare ist offenbar längst nicht so ausgeprägt.

Ich habe jedenfalls ebenso wie Sie immer nur die weißblaue Fluoreszenz in den Kernen der Säugerzelle gesehen, niemals eine grünliche Fluoreszenz im Zytoplasma. Möglicherweise liegt das auch daran, dass eine geringe grünliche Fluoreszenz völlig von den blauweißen Kernen überstrahlt wird. Die Gesamtfluoreszenz der Zelle wird praktisch nur durch den Kern determiniert, bei durchflusszytometrischen Messungen an gesunden nichtproliferierenden Zellen gewinnt man eine extrem schmale Verteilungskurve.

Die Kernfärbung mit DAPI ist eigentlich relativ unproblematisch, aber es gibt bekanntlich nichts, was nicht schief gehen kann. Was Sie schreiben, hört sich beinahe so an, als würde die gesamte Zelle blau fluoreszieren - das wäre dann ein deutliches Zeichen dafür, dass irgend etwas nicht stimmt und möglicherweise ein riesiger DAPI-Überschuss vorhanden ist. Nur der Kern darf weißblau fluoreszieren.

Mit Bakterien kenne ich mich nicht aus. Sicherlich gibt es bei Mikroben unterschiedliche Zustände, abhängig von der Spezies, dem Reproduktionszyklus und/oder der Stoffwechselaktivität. Aber welche Ausprägungen diese Unterschiede annehmen können, weiß ich nicht. Das ist eher ein Fall für den Herrn Cypionka.

Schönen Sonntagabend
Bernd

[Jeanette]

Hallo Frank,

aus meiner Arbeit (beruflich) mit RNA weiß ich, dass diese im Gegensatz zu DNA sehr instabil ist und sehr schnell von den zelleigenen RNasen abgebaut wird . Um RNA nachzuweisen, müssen die Proben speziell aufbereitet und die RNA fixiert werden. In meinem Fall (Leberzellen) müssen die Zellen direkt im Anschluss an die Kultur in eine Mischung aus Puffer und Mercaptoethanol überführt werden. An Mercaptoethanol ist privat wohl kaum ranzukommen und das Zeug stinkt wie die Pest, unbedingt nur unter dem Abzug arbeiten. Die Aktivität der RNasen beginnt bei Raumtemperatur innerhalb weniger Sekunden/Minuten, wenn man die Proben auf 4 Grad runterkühlt hat man etwas mehr Zeit. Bei einer einfachen Fixierung von Proben mit z.B. Aceton, Formaldehyd... und anschließender Dapifärbung konnte ich noch nie RNA im Fluoreszenzmikroskop sehen. Hoffentlich konnte ich Ihnen etwas weiterhelfen.

Liebe Grüße, Jeanette

[Frank S.]

Hallo Jeanette und Bernd,
ja, vielen Dank - das hat mir weitergeholfen und erklärt das erhaltene Färbeergebnis an den Epithelzellen.
Dass die Zellen außerhalb des Kerns bläulich sind, kommt wohl als Randerscherscheinung des fluoreszierenden Kerns.

Offen ist für mich noch die unterschiedliche Darstellung des Bakterienausstriches - da werde ich mich mal noch tiefer einlesen...

Viele Grüße
Frank

[bewie]

Hallo Jeanette,

ist zwar schon fast OT, aber bei der Gelegenheit trotzdem mal eine Frage an die Expertin: Kennen Sie das durchschnittliche Verhältnis der RNA-Menge zur DNA-Menge, beispielsweise in der Leberzelle? Ich suche aus reiner Neugierde seit einiger Zeit nach einer solchen Angabe, habe aber bis jetzt noch nichts finden können.

Neugierige Grüße
Bernd

[Rene]

Hallo Jeanette, I have used diatom cells for RNA detection with molecular probes. In one exp I had stored the samples for 4 months in 70% ethanol or 4% formaldehyde, and especially the ethanol preserved cells did work quite well for detecting ribosomal RNA. Small mRNA might have leaked out of the cell, I'm not sure, but RNA is not necessarily degraded without hefty treatments with mercapto or phenol.

Frank, if you check molecular probes http://probes.invitrogen.com/handbook/sections/0801.html, it looks like acridin orange would be a far better choice for this experiment.
Have you checked the bacteria you looked at without DAPI for autofluorescence?

Good luck, Rene.

[Frank S.]

Hallo Mikroforum,
ich bin mir bzgl. der Färbung der Bakterien etwas unsicher.
Folgend habe ich mal ein Bild eingestellt:

Es zeigt einen Bakterienausstrich mit DAPI gefärbt (keine Reinkultur) in 400 - facher Vergrößerung unter Fluoreszenzanregung.
Ich bin mir etwas unsicher ob die verschiedene Farbdarstellung evtl. nur von einer unterschiedlichen Färbeintensität her rührt.
Kann das jemand mit DAPI-Erfahrung beurteilen?

Eigenfluoreszenz spielt hier keine Rolle - das habe ich ausprobiert.

Viele Grüße
Frank Schwarzkopf

[Jeanette]

Hallo Bernd,

das Verhältnis von DNA:RNA beträgt in humanen Hepatozyten ungefähr 1:3-4. Direkt im Anschluss an eine ideal abgelaufene Isolation kann man pro Hepatozyt eine DNA-Menge von 6 pg und eine RNA-Menge von 18-24 pg erwarten. Während der Zellkultur kann der RNA-Gehalt allerdings stark schwanken.

Dear Rene,

I´m very surprised about your information regarding ribosomal RNA. I´didn´t know that rRNA has such a high stability. I´m usually working with mRNA and in that case our rate of yield is very different depending on treatment after cell isolation.

Hallo Frank,

ich habe noch nie Bakterien mit Dapi gefärbt, aber ich werde demnächst mal einige Fluoreszenzaufnahmen im Mikrofotobereich einstellen. Dann kannst Du Deine Ergebnisse vielleicht damit vergleichen.

Liebe Grüße, Jeanette

[Rene]

Hi Jeanette, it's a matter of fixation. Internal RNAses will be fixed in it's place by the ethanol and not working anymore. Of course in watery hybridization mixtures the RNA again is susceptible to degradation, for example if the probe or wash solutions are contaminated.

Rene

[bewie]

Hallo Jeanette,

das ist ja interessant! Angesichts der Kurzlebigkeit der RNA hätte ich nicht gedacht, dass so viel vorhanden ist. Andererseits sind die Leberzellen natürlich metabolisch hochaktiv, da muss wohl auch viel RNA produziert werden.

In jedem Fall vielen Dank!

Herzliche Grüße
Bernd

[Stef]

Hallo Frank,

ja, so sehen DAPI gefärbte Bakterien aus. Die Fluoreszenz ist sehr stark, man könnte die DAPI Lösung weniger konzentriert einsetzen und kürzer inkubieren. An den Fluoreszenzmikroskopen, die ich bisher benutzt habe konnte man ausserdem die Strahlungsintensität der Lampe runterregeln. Das gibt auch nochmal ein weniger stark leuchtendes Bild oder man macht es über die Bildbearbeitung am PC.
DAPI bindet auch unspezifisch an Polyanionen, wie Polyphosphat oder Natriumlaurylphosphat. Die Fluoreszenz ist dann bei Poly-P intensiv gelb, ansonsten eher fahlgelb.


LG
Stef

[Frank S.]

Hallo Stef,
danke für die Hinweise.
Mit welchen DAPI-Lösungskonzentrationen arbeitest du normalerweise?
Ich bin von 1mg / l H₂O dest. oder Methanol ausgegangen.

Gruss
Frank

[Stef]

Beispiel für Gesamtzellzahlbestimmung aus Bodenproben:

25 µl Paraformaldehyd-(oder Ethanol) fixierter Extrakt
100 µl steriles H2O
50 µl DAPI (1 µg/ml in 1xPBS)
20 min inkubieren

hier mal ein Beispiel einer Belebtschlammflocke aus einer Kläranlagenprobe mit Bakterien, die Poly-P speichern
 

LG
Stef

[Frank S.]

Hallo,
mir war bisher nicht bekannt, dass Bakterien auch Polyphosphate speichern können und diese bei der DAPI-Färbung dann anders (gelblich) dargestellt werden.
Diese Tatsache dürfte jedenfalls auch die verschiedenen Farben auf meinem Bild erklären.
Dient die Eigenschaft der Polyphosphatspeicherung denn der Bestimmung einer Bakterienart? Oder sind damit weitere Eigenschaften der Bakterien damit verbunden?

Vielen Dank und viele Grüße
Frank