Autor Thema: HISTOLOGIE: Zwölffingerdarm, Brunner-Drüsen, PAS Reaktion, LR White  (Gelesen 388 mal)

Ronald Schulte

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HISTOLOGIE: Zwölffingerdarm, Brunner-Drüsen, PAS Reaktion, LR White
« am: Juni 30, 2018, 20:53:37 Nachmittag »
HISTOLOGIE: Zwölffingerdarm, Brunner-Drüsen, PAS Reaktion, LR White

Ziel dieses Präparat war: beweisen dass das Sekret der Brunner-Drüsen Neutrales Schleim (Mucine [7]) enthalt.
Mucine kann mit die PAS Reaktion angezeigt werden.

Dazu habe ich ein Maus Duodenum eingebettet in LR White und geschnitten am Reichert-Jung Ultramikrotom mit Dreieck Glasmesser auf Wasserboote.



Bild 1,





Gewebe Aufbereitungsprotokoll:
- Darm ausnehmen und in dünne Scheiben schneiden;
- Immersions Fixierung in ein Formalin/Glutaraldehyde Gemisch 2%/2,5%;
- Gewebe in kleinere Blöckchen zerschneiden;
- Fixiertes Gewebe Spulen mit Leitungswasser;
- Gewebe entwässern in ein steigende Ethanolreihe (50%, 70%, 85%, 96%, 100%);
- Infiltration mit LR White und Ethanol 100% (1:1);
- Infiltration in LR White;
- Proben in Gelatinkapsel ausrichten, Probenzettel einbringen, Luftdicht abschliessen und auf 60 Grad in 48 Stunden ausharten;
- Proben in warmes Wasser bringen und befreien von Gelatine;
- Proben bearbeiten/Trimmen und am Mikrotom schneiden.

Das Schneiden von eine Probe und aufnehmen von coupes habe ich im Video festgelegt. Gezeigt wird ein Epon Block aber ein LR White Block ist identisch.

Das Video wird von meine eigene Server geladen und ist Virenfrei.
Um es zu Laden: HIER klicken.






Theorie über diese Drüsen,

Brunner-Drüsen [4],
Die Brunner-Drüsen in der Submukosa (auch der der Kerckring-Falten) sind ein spezifisches Kennzeichen des Duodenums des Menschen. Die Drüsen erstrecken sich bis zur Flexura duodenojejunalis (Grenze Duodenum/Jejunum [6]). Sie bestehen aus gewundenen und verzweigten Tubuli, deren Wand aus einem einschichtigen kubischen Epithel aufgebaut ist. Die Drüsenepithelzellen bilden ein alkalisches bikarbonat- und schleimhaltiges Sekret, das den sauren Magensaft neutralisiert und die Duodenumschleimhaut schützt. Zellhöhe, Zellstruktur und Kernmorphologie variieren in Abhängigkeit vom jeweiligen Funktionszustand. In hohen sekretreichen Zellen sind z.B. die Kerne abgeflacht, während sie in Zellen, die ihr Sekret abgegeben haben, eher flach oval oder kugelig sind. Die Feinstruktur unterscheidet sich deutlich von der der Becherzellen. Das raue ER (endoplasmatische Retikulum) ist umfangreich. Der Golgi-Apparat ist ausgedehnt, und die Sekretgranula sind im elektronenmikroskopischen Präparat relativ dicht.

Dr. Alka Rashmi Nag, schreibt das Brunner-Drüsen nicht nur beim Menschen sondern bei alle Saugetiere vorkommen [2].




Bild 2,

A = Region mit die Brunner_Drüsen;
B = Region mit Darmzotten.







Bild 3,

Detail aus Bild 2. Stitch von sechs Bilder, Objektiv Leitz plan apo 63x, na 1.4

Unten ist die Darmwand zu sehen mit Glatte Muskelzellen und eine kleine Vene gefüllt mit Blutzellen.
Oben sieht man das Drüsengewebe schon besser. Kubische Zellen mit ein Kern im Basalregion.







Bild 4,

Objektiv Leitz plan apo 63x, na 1.4

Eine Kubische Zelle ist Markiert. A = die Region wo sich das Sekret befindet.







Bild 5,

Eine Seite aus: „An atlas of histology“ von J. Rhodin [5]

In Bild 29-26 item 4 ist zu sehen dass das Sekret sich Apikal in die Zelle befindet und sehr fein Granuliert ist.









Die PAS Reaktion [1];

Die PAS-Reaktion ist eine häufig eingesetzte Färbetechnik in der Histologie. Es kommt dabei zur Anfärbung von Kohlenhydraten wie Glykogen, Cellulose, neutralen Mukopolysacchariden, Muko- und Glykoproteinen sowie Glykolipiden. Diese Substanzen sind beispielsweise in Bindegewebsfasern (Kollagen), Basalmembranen, Zellwänden (Glykokalix)und in neutralen Schleimen (Magenschleim) zu finden.

Prinzip
Durch die Periodsäure, ein starkes Oxidationsmittel, werden unsubstituierte Glycolgruppen zu zwei benachbarten Aldehydgruppen oxidiert. Das Schiffsche Reagenz enthält Fuchsinschweflige Säure (farblos). Durch Bindung an die Aldehydgruppen kommt es zu einem molekularen Umbau und die chromogene Eigenschaft entsteht – deutlich erkennbar an der magentaroten Farbe. Als kontrastreiche Kernfärbung wird eine Färbung mit Hämalaun (blaue Kerne) oder nach Van Gieson (VG) eingesetzt.



Protokoll PAS Reaktion (diese Farbezeiten habe ich empirisch festgestellt, jedoch nicht geeignet für Paraffine Schnitte).

- Perjodsaure 1% AD, 30min;
- Spulen AD 2x, ?30sec;
- Reagenz von Schiff*, 40min;
- Spulen AD;
- Gegenfärbung mit Haematoxylin (am besten Funktioniert eine säuere Variante, Gill, Ehrlich), 15min;
- Spulen AD (diese Spul stufe nicht vergessen weil sonst die Färbung Fleckig wird);
- Blauen* in Leitungswasser, 10min;
- Schnitte Trocknen auf die Warmeplatte 60?C, 15min;
- Eindecken Depex.

* Wohnt man in z.B. Sauerland wo kein ‚hartes‘ Leitungswasser vorhanden ist dann kann man auch ein Tropfen Ammoniak zum Wasser geben. 

* Das Reagenz kann selber hergestellt werden aus Pararosalin. Die Lösung sollte Klar bis leichtrosa sein und etwas schwefelig riechen. Wenn es Rötlich geworden ist muss es erneuert werden. https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10886





Bild 6,

PAS Reaktion, Objektiv Leitz plan apo 63x, na 1.4

Zwei Zellen sind Markiert. Das Mucine ist magenta-rot angefärbt also PAS Positiv.








Bild 7,

PAS Reaktion, Objektiv Leitz plan apo 63x, na 1.4

A = Brunner-Drüsen, Mucine ist magenta-rot angefärbt also PAS Positiv.
B = Schleimbecherzellen die auch PAS Positiv sind. Ein geübte Auge sieht aber unmittelbar den unterschied so das keine Verwechselung möglich ist. 







Bild 8,

PAS Reaktion, Objektiv Leitz plan apo 63x, na 1.4






Referenzen:

[1] Wikipedia, https://de.wikipedia.org/wiki/PAS-Reaktion
[2] Histological and Histochemical Observations on Brunner’s Glands of Guinea pig
[3] A Comparative Histochemical Study of Mucins Produced by Brunner’s Glands of Guinea Pig, Rabbit and Goat
[4] Sobotta Welsch, Lehrbuch Histologie, 2 Auflage, 2006, ISBN: 978-3-437-44430-2, Verdauungsorgane, Seite 377.
[5] An Atlas of Histology, 1975, ISBN:978-0195019445, Digestive system-intestines, Seite 324.
[6] Wikipedia, https://en.wikipedia.org/wiki/Duodenojejunal_flexure
[7] Wikipedia, https://de.wikipedia.org/wiki/Mucine


Viel spaß beim Anschauen, Gruße aus Franeker, Ronald
Mikroskope:
2x Leitz Orthoplan (DL, DF, Phako, POL, AL-Fluoreszenz, AL-DIC und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotome:
A&O 820 Rotationsmikrotom.
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.
Reichert Ultracut E Ultramikrotom.
LKB 7800 Glasmesser Brecher.

Ralf Feller

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Re: HISTOLOGIE: Zwölffingerdarm, Brunner-Drüsen, PAS Reaktion, LR White
« Antwort #1 am: Juli 01, 2018, 14:26:27 Nachmittag »
Hallo Ronald,

wie immer eine sehr gelungene Arbeit.
Wenn ich die Technovit- und Eponschnitte mit dem LR-White vergleiche,
dann scheint mir der Farbkontrast in Technovit und Epon besser zu sein.

Hat LR-White einen Vorteil gegenüber Epon und Technovit?
Kann man LR-White genau so dünn schneiden wie Epon.
Bei Technovit scheint mir die minimale Schnittdicke ja 1µm zu sein.

Grüße nach Holland, Ralf

Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Zwölffingerdarm, Brunner-Drüsen, PAS Reaktion, LR White
« Antwort #2 am: Juli 01, 2018, 19:04:14 Nachmittag »
@Ralf,

Mir scheint es auch das Kontraste von Färbungen in die verschiedene Schnitte variieren.
Ist aber schwierig um definitiv zu sagen das z.B. Epon bessere Kontraste gibt obwohl ich wohl dazu neige. Problem ist das nicht alle Blocke gleich sind und so wird eine Aussage auch wertlos.
Im Herbst aber, wenn ich die Fixativ testen machen werde, kann ich diese Fragestellung einfach mitbeziehen. Wird richtig interessant.

Die Schnittdicken die mit Epon und LR White zu machen sind ist Identisch. Muss auch weil beide Kunststoffe geeignet sind für die EM so ein Schnitt von 60nm muss möglich sein. Ich habe es schon mal probiert nur um zu sehen ob es wirklich geht. Ich kann dir melden: „es geht wirklich“.
Beide Kunststoffe schneide ich am liebsten auf 0,5µm. Dann ist die Morphologie am schönsten und Färbt sich es noch prima. LR White kann ich schlecht dicker schneiden wie ungefähr 0,8µm. Dann bilden sich im Schnitt schnell ‚wrinkles‘ (Deutsches Wort fehlt mir).
Grund dafür kann sein das ich das ‚Harte‘ LR White genommen habe. Es gibt auch ein ‚medium‘. Mit Epon lasst sich die Hartheit von die Blocke einfach steuern. Das Harz besteht aus vier verschiedene Flaschen.
Technovit 7100 schneide ich sowohl am Rotationsmikrotom (LKB 2218 Historange) und am Ultracut.
Am LKB mit Stahlmesser bis zu 1,5µm und am Ultra bis 0,5µm. Das aber wird trocken geschnitten und dazu habe eine sehr sehr feine Pinzette um kann am Glasmesser das Fummelchen wieder Entfummeln und dann strecken auf Wasser. Das ist nicht ganz einfach aber mit was Übung geht es doch.

Gruße Ronald
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Jürgen H.

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Re: HISTOLOGIE: Zwölffingerdarm, Brunner-Drüsen, PAS Reaktion, LR White
« Antwort #3 am: Juli 02, 2018, 12:50:35 Nachmittag »
Lieber Ronald,
wieder ein Spitzehistologiebeitrag von Dir! Je mehr wir uns mit Histologie beschäftigen, desto mehr staunen wir, wie komplex unser Leben aufgebaut ist, nicht wahr?

Hast Du einmal kontrolliert, mit welchem pH Wert Du die PAS Färbung durchführst?

Ich müsste für meine Insekten auch einmal Epon oder LR White probieren, das Mikrotom dazu hätte ich ja und die Glasmesser auch. Dazu schicke ich dIr eine PN.

Schöne Grüße

Jürgen

Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Zwölffingerdarm, Brunner-Drüsen, PAS Reaktion, LR White
« Antwort #4 am: Juli 05, 2018, 14:15:37 Nachmittag »
@Jürgen,

Ja das Schöne an die Histologie ist dass man auch was mehr von das Genom versteht und immer wieder staunt wie mächtig Kompliziert und wunderbar gebaut worden ist.

Ein PH wert für das Schiff habe ich nicht. Ich lagere es gekühlt und im Dunklen. Wenn die Flüssigkeit Klar oder leicht Rosa ist und noch etwas nach Schwefel riecht ist es in Ordnung. 
Ein Kontrollschnitt mitfuhren ist empfehlenswert, das um sicher zu gehen das die Reagens Flüssigkeit noch wirksam ist und dadurch keine falsche Aussage entstehen wurde.

Grüße Ronald
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