Autor Thema: HISTOLOGIE: Riesenchromosomen im Fluoreszenz  (Gelesen 850 mal)

Ronald Schulte

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HISTOLOGIE: Riesenchromosomen im Fluoreszenz
« am: September 22, 2018, 20:57:49 Nachmittag »
Letzte Woche sah ich in mein Drosophila Melanogaster (Fruchtfliege) Schnitt die schöne Speicheldrusen mit die Riesenchromosomen.
Um die Chromosomen Besser beobachten zu können kann man sie gut im Fluoreszenz anschauen. Dazu kann man die anfärben mit ein Farbstoff die bindet an DNA. Es gibt mehrere Sorten von Farbstoff. Ein typische und viel genutzte Fluoreszenz ist: 4?,6-Diamidin-2-phenylindol. Meist DAPI genannt. Wikipedia: https://de.wikipedia.org/wiki/4%E2%80%B2,6-Diamidin-2-phenylindol

Wikipedia gibt auch gute Information uber die Fruchtfliege: https://de.wikipedia.org/wiki/Drosophila_melanogaster

Auch hat Kollege Holger Adelmann schon mal ein schönen Chromosomenmorphologie-Beitrag gemacht: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=8643


Die Schnitte habe ich mit ein sehr verdünnten Lösung fünf Minuten Inkubiert.
Die Lösung abgegossen und ein Deckglas aufgelegt. Hier ist es wichtig um die Wasserschicht zwischen Schnitt und Deckglas so klein wie möglich zu halten. Ich drücke meist das Wasser aus und kann dann ungefähr 15 Minuten schauen bevor das Wasser anfangt zu verdunsten.

Bilder sind gemacht am Leitz Orthoplan mit Fluoreszenz Einrichtung. Hier im UV Bereich (Filter Würfel A).


Ein Übersicht (in Toluidin Blau Farbung) lasst Bild 1 sehen. Die Drusen liegen in die Mitte. Die große Kerne sind hier schon zu beobachten.



Bild 1,






Übersicht im Fluoreszenz. Objektiv Leitz NPL Fluotar 25x
Alle DNA wird Blau angefärbt.

Bild 2,







Weiteren Übersicht im Fluoreszenz. Objektiv Leitz NPL Fluotar 40x

Bild 3,







Die Bilder sind mit den 100x Objektiv nicht so knackig scharf wie ich gerne möchte aber ich traue es nicht um mein 63x im Fluoreszenz einzusetzen.
Objektiv Leitz NPL Fluotar 100x

Bild 4,







Objektiv Leitz NPL Fluotar 100x

Bild 5,





Viel Spaß beim Anschauen, Gruße Ronald
« Letzte Änderung: September 22, 2018, 21:01:36 Nachmittag von Ronald Schulte »
Mikroskope:
2x Leitz Orthoplan (DL, DF, Phako, POL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotome:
A&O 820 Rotationsmikrotom.
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.
Reichert Ultracut E Ultramikrotom.
LKB 7800 Glasmesser Brecher.

momotaro

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Re: HISTOLOGIE: Riesenchromosomen im Fluoreszenz
« Antwort #1 am: September 22, 2018, 22:16:12 Nachmittag »
Hi Roland

Leuk!

Wirklich beeindruckend!

Wenn Du Nichts dagegen hast, habe ich ein paar technische Fragen:

In welcher Zubereitung wendest Du DAPI an?

DAPI ist ja nicht gerade billig, und nicht unbedingt stabil. Verwendest Du gebrauchsfertige Lösungen oder setzt Du die Lösung selber an? In welcher Menge kauftst Du DAPI, wie lagerst Du DAPI und wie lange ist es haltbar?

LG Helmut





Ralf Feller

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Re: HISTOLOGIE: Riesenchromosomen im Fluoreszenz
« Antwort #2 am: September 22, 2018, 22:31:22 Nachmittag »
Hallo Ronald,
das ist wieder KLASSE!

Mich würde auch interessieren welches DAPI du nimmst?

Hast du den ganzen Schnitt, wie er in der Übersicht zu sehen ist mit DAPI inkubiert?
War das Präparat vor der DAPI Behandlung gefärbt?
Wo finde ich in der Übersicht die Speicheldrüsen?

viele Grüße nach Holland, Ralf

Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Riesenchromosomen im Fluoreszenz
« Antwort #3 am: September 23, 2018, 21:16:07 Nachmittag »
@Helmut und Ralf,

Mein Dapi habe ich mir von eine Uni hier in Holland besorgt.
Ich wusste schon das es ziemlich teuer ist aber wenn ich suche was es heute kostet und wie lange man versorgt ist dann kostet es eigentlich nicht viel.
Sigma verlangt da 35 Euro für ein Milligramm. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=en&region=NL
Ich nehme ein Milligramm Dapi und löse es in 1 Milliliter AD. Dann pipettiere ich 50µl in 20 Eppendorf Reaktion Gefäße. Die Lösung ist, laut Sigma, einige Wochen Stabil aber wenn du die Gefäße aufbewahrst im Frierfach auf -18 Grad Celsius dann kannst du es für Jahre lagern ohne Verluste. Wichtig ist das es Licht geschützt gelagert wird. Ich habe da so ein Kunststoff Gefäß die ich mit Aluminium Folie abgesichert habe und darin Lagere ich die Gefäße. Funktioniert Prima.
Wenn ich dann ein Dapi versuch machen möchte dann Bereite ich alles vor und sorge das ich mehrere Präparaten habe die ich anschauen möchte.  Ein Gefäß mit Dapi Losung taugt sehr schnell auf und verdünne ich dann mit 30-40 Milliliter AD.
In mein Fall lege ich einige Technovit Präparaten Horizontal auf kleine 50ml Becherglaser und Inkubiere die dann mit Dapi Lösung. Hier muss was mit die Inkubationszeit experimentiert werden. Ein Schnitt von z.B. 1µm dick Inkubiere ich ungefähr fünf Minuten. Lasse die Flüssigkeit ablaufen und gebe ein Tropen AD auf. Dann lege ich ein Deckglas auf die groß genug ist. Wichtig ist zu wissen wo sich den Schnitt oder Schnitte befinden weil man ja kein Schnitte mehr sehen kann. Ein Tipp für scharfe Bilder: das Deckglas etwas andrucken so das nur sehr wenig Wasser zwischen OT und Deckglas ist. Man hat so ungefähr 15 Minuten Zeit bevor das Wasser anfangt zu verdunsten.

Wenn Immersion Öl genutzt wird dann sollte das unbedingt Fluoreszenz freies Öl sein.


Bleibt noch die wichtige Warnung, sauber und mit Handschuhen zu arbeiten. Die Substanzen keinesfalls einatmen oder verschlucken. Alle Fluoreszenzfarbstoffe, besonders aber die mit starker Bindung an die DNA (z.B. DAPI oder Ethidiumbromid) sind potentiell mutagen und karzinogen!



@Ralf, die Drusen liegen im Roten Kreis.








Hier ist die Larve am Ultracut zu beobachten.



Gruße Ronald
Mikroskope:
2x Leitz Orthoplan (DL, DF, Phako, POL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotome:
A&O 820 Rotationsmikrotom.
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.
Reichert Ultracut E Ultramikrotom.
LKB 7800 Glasmesser Brecher.

Michael L.

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Re: HISTOLOGIE: Riesenchromosomen im Fluoreszenz
« Antwort #4 am: September 27, 2018, 07:21:24 Vormittag »
Hallo Ronald,

danke für die beeindruckenden Aufnahmen und die genaue Methodenbeschreibung.

Viele Grüße,

Michael