Paraffinschnitte erste Gehversuche

Gernot Armbruster · Oktober 21, 2018, 00:02:17 VORMITTAG

Lieber Jürgen,

da ist nun der nächste Block. Auf dem Holzklötzchen steht drauf:"Tulipa Fruchtknoten sp FPA, Ex, Butanol Rotiplast". Leider bekomme ich selbst mit dem 1,6x-Objektiv nicht die ganze Probe auf das Bild. Die Unreinheiten kommen von meinen uralten Objektträgern. Aber ich denke zum Üben und Lernen sind sie noch zu gebrauchen. Wenn es "ernst" wird muss ich mir onehin neue beschaffen. welche sind denn für den Hobbymikroskopierer empfehlenswert?

Das Mikrotom ist von R.Jung Heidelberg, mit der Fabriknummer 40291. Mehr steht nicht drauf. Das ganze Gerät wiegt 25Kg. Das Messer ist mit 2 Schrauben fest eingespannt. Es ist alles sehr massiv gebaut.

Danke für den Link von K. Henkel, bin schon beim Lesen.

Schöne Grüße

Gernot

Klaus Herrmann · Oktober 21, 2018, 10:43:15 VORMITTAG

Hallo Gernot,

wenn du weiter so gute Schnitte machst solltest du mal in Erwägung ziehen die OT vorher zu putzen. Ich mach das immer mit etwas ATA auf Daumen und Zeigefinger. Damit putze ich den angefeuchteten OT und spüle danach gut ab. Wirkt Wunder! Wenn man Serien verarbeitet sind frische wirklich saubere etwas Zeit sparender.

Jürgen H. · Oktober 21, 2018, 12:15:00 NACHMITTAGS

Na also, lieber Gernot!

Da kannst Du langsam daran denken, bei Klaus eine vernünftige Farbmischung zu kaufen, und soweit noch nicht vorhanden, alles zum selbst Einbetten, dann wirds noch besser.

Erster Schritt wäre allerdings, mit sauberen OTs zu arbeiten. Ich schwöre für meine Zwecke auf Knittel, aber ich denke, die Wahl der OTs ist nicht so entscheidend, sie sollten allerdings bei Dir schon sauber ankommen. Auch dann ist reinigen unerlässlich, im Forum gibt es dutzende Arbeitsanweisungen hierfür.

Wenn Klaus hierfür - ernsthaft, lieber Klaus, Ata? nee, also wirklich - ein Scheuersandmittel vorschlägt, kannst Du mal sehen, was er von Deinen OTs hält.

Du wirst schon sehen: Wenns nicht sauber ist, hundertprozentig, auch bei den Flüssigkeiten (Filtern), liegt immer irgendwo ein Flusel, und zwar immer! an der im Übrigen schönsten Stelle im Schnitt. Wie hier auch.....

Weiterhin viel Erfolg!

Jürgen

Klaus Herrmann · Oktober 21, 2018, 15:03:55 NACHMITTAGS

ZitatWenn Klaus hierfür - ernsthaft, lieber Klaus, Ata? nee, also wirklich - ein Scheuersandmittel vorschlägt, kannst Du mal sehen, was er von Deinen OTs hält.

Im Ernst liebr Jürgen. Der "Scheuersand" ist ja nicht so hart wie Glas. Ich habe noch nie einen OT damit verkratzt, aber wenn sie so richtig verranzt sind ("geputzt, gebrauchsfertig"

) dann geht es damit am schnellsten.

ZitatDa kannst Du langsam daran denken, bei Klaus eine vernünftige Farbmischung zu kaufen

Das kann ich seit heute mit noch besserem Gewissen nur empfehlen. Mein neuer Etzold Blau Ansatz ist sehr gelungen und nachdem ich für viel Geld neues Alcianblau gekauft habe ist Wacker ASim II jetzt wieder eine Pracht.
Ich hatte einen Ansatz Alcian Blau von Fluka "für Mikroskopie" der nach Stehen wieder ausgeflockt ist und praktisch nicht gefärbt hat. Ich habe es erst durch eine Reklamation gemerkt. Beim Dörnbertreffen habe einige von diesem Ansatz gekauft. Ich bitte um Verzeihung, ich werde Ersatz liefern!

Gernot Armbruster · Oktober 21, 2018, 19:19:27 NACHMITTAGS

Zitat von: Klaus Herrmann in Oktober 21, 2018, 10:43:15 VORMITTAG
wenn du weiter so gute Schnitte machst solltest du mal in Erwägung ziehen die OT vorher zu putzen. Ich mach das immer mit etwas ATA auf Daumen und Zeigefinger. Damit putze ich den angefeuchteten OT und spüle danach gut ab. Wirkt Wunder! Wenn man Serien verarbeitet sind frische wirklich saubere etwas Zeit sparender.

Hallo Klaus,

das habe ich sofort probiert und es funktioniert wirklich. abgewischt habe ich mit "Whatman Lens cleaning Tissue" , das erste Tuch, das ich in Händen habe, das nicht fusselt!

Schöne Grüße
Gernot

Gernot Armbruster · Oktober 21, 2018, 20:40:24 NACHMITTAGS

Zitat von: Jürgen H. in Oktober 21, 2018, 12:15:00 NACHMITTAGS
Na also, lieber Gernot!

Ja es freut mich auch, dass es doch gelungen ist, dank Deiner und Eurer Hilfe in diesem super Forum. Wegen der Färberei bin ich mit Klaus schon in Kontakt getreten.

Liebe Grüße

Gernot

Gernot Armbruster · Oktober 29, 2018, 19:49:51 NACHMITTAGS

Hallo Experten,

nun geht es weiter mit den Färbemitteln von Klaus Herrmann, die ich jetzt zur Verfügung habe, und hoffe wieder auf Eure geschätzte Fachkritik.

Bild 1 ist wieder eine Tulpia sp Fruchtknoten, Etzold ohne Differenzierung.
Bild 2 das selbe mit 70% Etanol Differenzierung. Nach einigen Sekunden war alles Rot verschwunden.
Bild 3 Adlerfarn, Wacker A Sim II
Bild 4 das selbe als Ausschnitt.

Astralblau-Safranin habe ich auch probiert, ist aber komplett daneben gegangen. (Geschätzte 1000Luftblasen). ist schon in der Tonne.

Zwei neue Lehren habe ich dabei erfahren, 1) alle OT werden mit einer dünnen Schicht Krauter`s Glyzerin Gelatine überzogen, und 2) das Deckglas wird nach Methode R.Wacker aufgelegt: Auf das Deckglas kommt ein Tropfen Euparal, darauf kommt der OT mit dem Schnitt nach unten und alles wird schnell umgedreht, DG nach oben.

Ich würde gerne den Text zu den jeweils zugehörigen Bildern schreiben aber wie geht das?

Gernot Armbruster · Oktober 29, 2018, 19:52:06 NACHMITTAGS

Die Bilder 3 und 4 muß ich extra eingeben, waren zu groß. Auch das werde ich noch lernen!

Jürgen H. · Oktober 29, 2018, 21:06:04 NACHMITTAGS

Lieber Gernot,

zunächst einen Glückwunsch zu den wesentlich verbesserten Schnitten.

Zu den Färbungen der pflanzlichen Mikrotechnik kann ich leider kaum etwas beitragen. Die Färberei ist im Übrigen, wenn man es genau machen will, recht komplex: Fixiermittel, Fixierzeit, Einbettung, Schnittdicke, Färbezeit, pH Wert und maches mehr spielt eine Rolle. Leider kennst Du ja die Fixierung nicht. Aber Dein Vorgehen bei der Färbung könntest Du einmal genau darstellen, so blass dürfte ein 20 müSchnitt nicht daherkommen. Dann wird Dir sicher jemand aus dem Forum weiterhelfen können.

Schöne Grüße

Jürgen

Bob · Oktober 29, 2018, 21:20:02 NACHMITTAGS

Hallo Gernot,

mein Kommentar als nicht-Fachmann: Sieht prima aus!

Du hast Deine Technik in kurzer Zeit deutlich verbessert, und ich wäre damit vermutlich schon als Endergebnis zufrieden.
Die blass erscheinende Färbung könnte auch durch die Fototechnik verursacht worden sein. Vielleicht kannst Du durch andere Belichtung und Bildbearbeitung noch etwas rausholen. Das viele Weiß im Bild macht ja die Belichtungsmessung etwas schwieriger.

Viele Grüße,

Bob

Klaus Herrmann · Oktober 29, 2018, 22:59:21 NACHMITTAGS

Hallo Gernot,

die Etzold Färbung ist gut gelungen. Differenziert mit 70% Ethanol und das Rot ist komplett weg. Klar, das ist ein netter Versuch, aber die Färbung ist hin. Bild 1 zeigt: da gibt es keinen Grund zu differenzieren!

Bei der Wackerfärbung meine ich fast, dass dafür der Schnitt zu dünn ist. Wo nix ist kann auch keine Farbe aufziehen. Du könntest beim Färben etwas erwärmen, da zieht mehr Farbe auf.

Aber ansonsten: du bist auf einem steil ansteigenden Lernkurve-Ast!

Klaus Herrmann · Oktober 30, 2018, 10:21:12 VORMITTAG

Noch eine kleine Ergänzung: bei botanischen Schnitten sind Schnittdicken ab 20µ aufwärts oft besser, weil im Gegensatz zu tierischem Gewebe das botanische nicht so dicht ist (von Lungengewebe abgesehen) "Häkeldeckchen" wird da auch weniger Farbe gebunden und die Schnitte werden blasser.
Wenn du etwas mehr verholztes nimmst wird der Rotanteil auch höher.

ZitatAstralblau-Safranin habe ich auch probiert, ist aber komplett daneben gegangen. (Geschätzte 1000Luftblasen). ist schon in der Tonne.

Das kann aber nicht an der Färbung liegen! Die Differenzierung mit Salzsäure-Ethanol ist m. E. zu heftig.

Gernot Armbruster · Oktober 30, 2018, 11:28:23 VORMITTAG

Liebes Beratungsteam,
vielen Dank für die aufmunternden Worte. Das baut natürlich ungemein auf!

Lieber Jürgen,
von den hier dargestellten Proben hat sich die Beschriftung der Klötzchen leider schon verabschiedet. aber auf einigen anderen kann ich lesen: "Butanol, Rotiplast". Es kann also angenommen werden, dass das auf alle Klötzchen zutrifft. Von der Fixierung kann man nichts finden.

Bei der Färbung bin ich wie folgt vorgegangen: 3x10min Roti-Histol - je 2x5min Iso 100%-98%-90%-60%-3x5min Aqua dest .- Wasser weitgehend abkippen bzw. absaugen - Schnitt mit Etzold ganz bedecken - Färbezeit 12,5min - Farbe absaugen - mit Wasser waschen bis keine Farbwolke mehr abgeht. Im Falle von Bild 2 habe ich mit 70% Etanol einige Sekunden fixiert. - Sofort mit 100% Isoprop in 3 Stufen- 10sek-2min-2min entwässern - mit Euparal wie beschrieben eindecken - und ab auf die Wärmeplatte mit ca 50°C.

Im Falle der Wacker-Färbung nach Aqua dest.: Mit der Rotkomponente min 5min färben - rot abziehen - mit Blau nachfärben 30sec. - mit Wasser waschen bis keine Farbe mehr abgeht - Wasser weitgehend entfernen und kurz mit 100% Isopropanol spülen - gleich das Iso wechseln ca1min dann nochmals frisches Iso ca 3min einwirken lassen - leicht feucht mit Euparal eindecken.

Hallo Bob,
ich glaube an der Fototechnik kann es nicht liegen. ich verwende eine Nikon D810, fotografiere nur in RAW und die Belichtung ermittle ich ausschließlich mit der Histogrammkurve, verlasse mich also nicht auf die interne Belichtungsmessung. Entwickelt wird dann in Lightroom. Da kommen die Farben fast genau so wie ich sie durch das Okular sehe.

Hallo Klaus,
Werde also künftig 30My für Botanik einstellen?
Sollte ich bei Astralblau-Safranin die Differenzierung mit Salzsäure-Ethanol ganz weglassen?
Ich lese immer wieder, dass für die Alkoholstufen Ehtanol verwendet wird. Andere empfehlen wieder Isopropanol (ist 2-Propanol das selbe?). Was ist dafür entscheidend, ob Ethanol oder Iso Verwendug findet?

Jetzt steht mir noch die dritte Stufe bevor, das Herstellen der Paraffinblöcke. Wie geht da der Hobbymikroskopiker am besten vor? soll man die Kassetten beschaffen oder mit den althergebrachten Holzklötzchen arbeiten?

Schöne Grüße

Gernot

Jürgen H. · Oktober 30, 2018, 15:30:28 NACHMITTAGS

Lieber Gernot,

die Arbeitsanweisung für Etzold findest Du in der Mikrofibel, bitte beachten, dass es zwei Varianten Etzold gibt. Hast Du nicht den mit dem Farbstoff bedeckten Ot erhitzt?

Schöne Grüße

Jürgen

Bob · Oktober 30, 2018, 15:48:15 NACHMITTAGS

Hallo Gernot,
an der Fototechnik wird es dann schonmal nicht liegen.
Zur Herstellung von Paraffinschnitten hat unser Georg Rosenfeld etwas geschrieben:
http://www.mikrohamburg.de/Tips/Paraffinschnitte_02.pdf
Als er die Maus in der Zoohandlung kaufte, sagte der Verkäufer wohl, dass er an dem Tier sicher viel Freude haben werde...

Viele Grüße,

Bob