Gehirngewebe von der Maus, eingebettet in Epon812

[Ronald Schulte]

Gehirngewebe von der Maus, eingebettet in Epon812.


Ich habe mal versucht um Gewebe so zu fixieren das es tauglich ist für das Elektronen Mikroskop. Wenn es also optimal für die EM fixiert ist muss es doch auch für das LM am besten fixiert sein war mein Gedächtnis. Ob das Gespinste sind oder Wahrheit ist kann man nur herausfinden wenn man das Experiment mal durchführt.
Dazu hat mich ein freundlichen Forumsmitglied mal was frisches Glutaraldehyd geschenkt und habe ich mich ein Gramm Osmium Tetroxid besorgt.
Das Epon Harz hatte ich schon im Schrank und da musste nur nochmal ein Maus dran aber in Holland ist das nicht so schwierig um die zu bekommen.
Das fertige Block ist geschnitten am Reichert Jung Ultracut E Ultramikrotom mit Glasmesser und Wasserboot. Gefärbt ist mit Toluidine Blau (1%) in Tetraborat (1%).
Die Bilder habe ich in Schwarz weis dargestellt weil so die Details besser zu sehen sind.
Alle Bilder sind hergestellt am Leitz Orthoplan mit das 63x Plan apo n.a. 1.4.
Kamera: Canon 700D


Bild 1





Bild 2
Linksoben ist eine Flasche mit das Gehirngewebe zu sehen. Hier schon Fixiert und in Teilen geschnitten. Linksunten sieht man ein Detail von diese Flasche. Ich bewahre mein Fixiertes Gewebe auf in Isopropanol 80%.
Rechtsoben sieht man einige Osmierte Gewebe Stucke (hier zufällig Leber). Wenn Osmiert wird dann färbt sich jedes Gewebe Schwarz.






Bild 3
Das Cerebrum Block in verschiedene Positionen. Epon wird, wenn es gemischt wird, immer Gelblich. Das ist normal. Übrigens habe ich es bei EMS gekauft. https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/14120.aspx






Bild 4 und 5
Hier ist das Osmium Tetroxid zu sehen.
Die Glas Ampulle wird sorgfältig gereinigt und in ein saubere Glas Flasche mit ein Glasstab zerschlagen. 1gramm Osmium wird in 100ml AD gelost. Da sich das Osmium nur sehr schlecht löst ist es wichtig um ein Tag vorher das Osmium anzusetzen.

Osmium Tatraoxid ist extrem Giftig. Siehe die Gestis Substance Database: http://gestis-en.itrust.de/nxt/gateway.dll/gestis_en/004280.xml?f=templates$fn=default.htm$3.0








Bild 6
Hier öffne ich die betäubte Maus.







Bild 7
Das Sternum wird weggeschnitten, um mehr Platz zu bekommen.
Jetzt kann begonnen werden mit entnehmen von das Gewünschte Gewebe.
Um das Gehirn zu bekommen muss von die Kopfobenseite (Kranial) das Schädeldach geöffnet werden. Das ist nicht ganz einfach aber Übung ist hier angesagt.







Bild 8
Ein Bild aus Welsch Sobotta: Lehrbuch Histologie







Bild 9
A = Neuron mit große Nucleus und Nucleolus;
B = Axon;
C = Kern von eine Gliazelle.
Zitat Sobotta: Die Gliazellen sind unabdingbare Hilfszellen der Nervenzellen, deren spezifische Funktionen von ihnen abhängig sind. Ihre Zahl ist noch großer als die der Nervenzellen und übertrifft sie um das 10fache.
Zu den zentralen Gliazellen werden gezahlt:
- Astrozyten;
- Oligodendrozyten;
- Mikrogliazellen.






Bild 10
Die Markscheiden sind hier Quer und Langs angeschnitten.







Bild 11
Die Markscheiden sind hier Quer angeschnitten und haben verschiedene großen.







Bild 12
Im ersten Übersicht Bild sind in die Mitte einige ,Strangen' mit Nerven zu sehen. In dieses Bild sieht man ein Detail davon.




Gruße Ronald

[M.Butkay]

Hallo Roland,

sehr gut die Arbeitsvorgehensweise beschriebenen. Von dem Osmium Tatraoxid habe ich auch noch was rumliegen. War zum fixieren vom Ciliaten gedacht. Habe es nie wegen der Giftigkeit benutzt.

Danke fürs zeigen, man kann hier im Forum nur dazu lernen...

Viele Grüße,
Michael

[Jürgen H.]

Lieber Ronald,

tolle Darstellung sowohl des Verfahrens als auch des Ergebnisses.

Was mich jetzt interessieren würde wäre der 1:1 Vergleich der unterschiedlichen Fixierungen im Ergebnis. Beschränken sich die Verbesserungen durch die Osmierung auf einen Vergrößerungsbereich, der nur dem Elektronenmikroskop zugänglich ist, oder sind auch im Lichtmikroskop mehr Details zu sehen, als z.B. bei der Karnovskyfixierung? Ich ahne aufgrund Deiner Bilder, dass Letzteres der Fall ist, aber wenn Du Zeit und Lust zu dieser Erweiterung Deines Experimentes hättest, wäre es schön, einmal den unmittelbaren Vergleich der Fixierungen zu sehen. Erst dann könnte man ja wirklich sagen, dass die Osmierung auch für das Lichtmikroskop die besten Ergebnisse liefert. Den bemerkenswerten Unterschied zwischen reiner Formainfixierung und Karnovsky hattest Du ja schon einmal vorgeführt.

Schöne Grüße

Jürgen

[Ronald Schulte]

Jürgen,

Ich weiß genau was du gerne hören möchtest und das Ergebnis hoffe ich auch zukünftig geben zu können. Ich muss aber noch weitere Blocke herstellen und weiter Schneiden.
Zuerst habe ich getestet ob sich Osmiertes Gewebe in LR White und in Technovit 7100 einbetten lasst (Epon 812 ist kein Problem, das wusste ich schon). Da kann ich schon berichten das beides ohne Probleme Funktioniert. Auch das schneiden geht ohne Probleme. Früher habe ich schon mal ein Stuck Gewebe über eine Nacht Osmiert aber das ist dann wirklich zu lange. Das kann man nicht mehr einbetten und gar nicht mehr schneiden. Jetzt Osmiere ich nicht langer wie zwei Stunden und das ist richtig. Beikommendes elend ist das die Gewebe Stucke nur sehr klein sein dürfen weil das Osmium nur sehr langsam in das Gewebe eindringt. Du musst denken an ein Stückchen von 1x2x2mm Maximal. In Bild 3 kannst du schon sehen wie klein die Proben sind.

Gruße Ronald

[Ralf Feller]

Hallo Ronald,

das ist eine tolle Darstellung von Nervengewebe!
Besonders die Markscheiden habe ich so ohne Osmierung noch nie gesehen und
ich denke das das auf die Stabilisierung von lipophilen Substanzen durch das
Osmium zurückgeht.
Den Vergleich zeigst du ja selbst in deinem Beitrag von 2013
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=17458.0
Ich denke, da kann man schon einen Unterschied sehen.

Du sagst, was mich natürlich besonders interessiert, das sich das osmierte Gewebe
auch in Technovit einbetten lässt? Habe ich das richtig gelesen?

Wie dick sind denn die Eponschnitte?

Nach dem Osmieren muss das Gewebe ja gewässert, nimmst du da Wasser oder
Puffer, und wie lange dauert das?

Gibt es einen Grund warum du die Konzentrationen von Formaldehyd und
Glutaraldehyd erhöht hast?

Wie kann man die wässrige OsO4-Lösung denn aufbewahren und wie lange hält das.
Ich habe auch noch eine Ampulle hier liegen, aber noch ungeöffnet, und habe mir
leere Glasampullen zum zuschmelzen bestellt.
Ich weiß, das Plastikdeckel undicht werden und schnell zerstört werden.
Ist es ein Problem mit der wässrigen OsO4-Lösung ohne Abzug zu arbeiten?

Ich freue mich auf weitere Ergebnisse,

Grüsse nach Holland, Ralf

[derda]

Guten Moin Ronald,

vielen Dank fürs Teilen deines Beitrages. Aus reiner Neugierde: wie lang ist ungefähr die Kantenlänge deiner Bilder?

Viele Grüße

Erik

[Ronald Schulte]

@Erik,

Die Kantenlangen von das ursprüngliche Bild ist 5184 x 3456 Pixel die ich dann verkleinere nach Forumstaugliche Bilder von 900 x 515 Pixel.
Wenn du die Kantenlange mein Schnitt meinst ist es: Den Epon Schnitt hat so 2 x 2mm und das Gewebe im Block hat hier so ungefähr 2 x 1mm. In Bild 3 kannst du rechtsunten den rechteckige Spiegelende Schnittteil sehen.


@Ralf,

Ja das Osmium hat sicher Einfluss aber auch das erhöhte Formaline/Glutaraldehyde hat leider auch negativen Einfluss vermute ich (sind aber noch Vermutungen).
Weil ich auch nicht Osmiertes Gehirn habe kann ich das mal testen. Leider aber habe ich das in diesen einbette ,batch' nicht mitgenommen.
Die Schnittdicke hier ist 0,5µm. Das lasst sich aber noch prima Farben. Ein 0,5µm Schnitt in Technovit Färbt sich nur noch Massig bis Schlecht.
Den Grund für die erhöhte Konzentration (4%/5%) war ein Tipp von Carsten Dittmayer (ankommend?  Pathologe aus Berlin). Speziell für Gehirn Gewebe sollte diese Originale Karnovsky Konzentration eine bessere Darstellung von einige Gewebesorten darstellen. Das kann ich in die Markscheiden deutlich erkennen aber die Neuronen (Zellleiber) und kleine Blutgefäße mit Erythrozyten haben gelitten. Besonders zu beobachten ist das ich neben so ein Neuron Normal nur Grundstruktur sehe mit hier und da quer geschnittene Axonen, hier aber sehe ich viel mehr Axonen und Dendriten. Hat sicher so sein Einfluss.

Das Osmierte Gewebe lasst sich auch Prima in LR White und Technovit 7100 einbetten und auch das Schneiden geht problemlos. Ich habe aber noch zu wenig Resultaten um aussagen machen zu können. Da habe ich die ,Karnovsky half strenght' genommen also 2%/2,5%. In ein Duodenum Schnitt sehe ich z.B. das die Pannetische Zellen mit das Granulat in LR White nur massig gefärbt ist und in Technovit sehr stark gefärbt ist. Gewebe von das gleiche Tier in gleiche umstanden Fixiert, Osmiert, Dehydriert, gefärbt usw. Da macht sich die Unterschiede deutlich merkbar aber alles noch zu früh um aussagen zu machen.

Die Bewässerung anschließend am Fixativ war 22 Stunden und anschließend am Osmieren war 6 Stunden. Alles im gleichen Puffer wie auch das Fixiermittel gepuffert war. Die Puffersalze waren: KH2PO4 und Na2HPO4 . 2H2O. Den PH wert habe ich auf 7.17 eingestellt.



Zum Aufbewahren von Osmium kann ich nichts sagen und auch das Arbeiten mit Osmium muss sehr sorgfältig geschehen. Siehe in diesen Link das Blatt ,safe handling'.

http://gestis-en.itrust.de/nxt/gateway.dll/gestis_en/004280.xml?f=templates$fn=default.htm$3.0

Grusse Ronald

[derda]

Guten Morgen Ronald,

sorry, da hatte ich mich etwas missverständlich ausgedrückt. Ich wollte eigentlich die Größe des angeschnittenen Neurons abschätzen und, da kein Maßbalken zu sehen ist, die ungefähre Kantenlänge des ersten Bildes in µm/mm wissen.

Die einzelnen Proben sind ja schon mikroskopisch klein ;-) Gibt es eigentlich Programme mit denen man die einzelnen Schnittlagen übereinander legen und am Ende wie bei einer CT-Aufnahme durchmustern kann?

Viele Grüße

Erik

[Ronald Schulte]

Erik,

Ja die Programme gibt es. Ich war mal eingeladen bei: ,,The UMCG Microscopy and Imaging Center (UMIC)" in die Universität von Groningen.
Da werden zum Beispiel hundert Nierenschnitte, die alle in Reihenfolge geschnitten sind, über Nacht Fotografiert (alles mit 63x na 1.4 Objektive). Alles Automatisch. Am nächsten Morgen ist dann das fertige 3D Bild gerendert und fertig zum Anschauen.

Link zum ,,Imaging Center": https://www.rug.nl/umcg/research/microscopy-center/.

Mein einfaches Stitch Arbeit mache ich mit Photoshop CS2. Schon was alter aber für mich das beste Stitch Programm wo man auch mal 400 Bilder auf einmal stitchen kann.
Stacking mach ich fast nie, das ist mehr was für die Pflanzenleute hier. Die kennen sich da viel besser aus.


Gruße Ronald