Autor Thema: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung  (Gelesen 945 mal)

Bob

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Hallo zusammen,
ich habe gerade einen Zeiss Auflicht-Fluoreszenzkondensor III RS bekommen und gleich ausprobiert.
Als Lichtquelle musste eine Taschenlampe (weiß, gebündelter Strahl) und ein kleiner Spiegel herhalten.
Für einen so improvisierten Test bin ich schon ganz zufrieden damit.
Einen Auflicht-Aperturblendeneinsatz für mein Phomi 1, zweite Ausführung, habe ich noch nicht. Von da her überlege ich, erstmal eine oder mehrere LEDs dahinter zu setzen. Vielleicht blau und grün, auf UV werde ich wohl lieber verzichten.

Viele Grüße,

Bob

jonson052

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #1 am: Oktober 09, 2019, 23:19:34 Nachmittag »
Hallo Bob,

wenn du nach einer passenden LED dafür suchst, würde ich eine Cree XM-L Color in Betracht ziehen, das sind vier Emitter auf einem Chip.
Siehe hier: https://www.cree.com/led-components/media/documents/XLampXML_Color.pdf
Da die ziemlich nahe zusammen liegen, hat man quasi eine LED mit vier verschiedenen Spektren zur Verfügung: Rot, Grün, Blau und noch eine Variante von Weiß (neutral ist recht gut).

Viele Grüße
Johannes

liftboy

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #2 am: Oktober 10, 2019, 10:44:50 Vormittag »
Hallo Bob,

nun hat es mich auch geritten :-)
also flugs UV-Taschenlampe ausgepackt und Testbilder gemacht,
erstmal im Auflicht



und dann im Durchlicht.

den Unterschied find ich schon interessant; die Unschärfe im Auflicht ist wohl dem Deckglas geschuldet.

Nun noch einen hinterher (wenn ichs doch hab)
Ans Lomo Lumam den UV-Brenner gehängt und Vollgas (Ozon)

insgesamt wesetlich heller, aber deutlich unschärfer. Ursache hier vermutlich die Optik!
Bild 1 ist mit der Taschenlampe seitlich, Bild 3 mit Orginal Durchlicht durch das Objektiv (mit reichlich Eigenfluoreszenz)
Da wäre dann das Auflichtobjektiv besser gewesen, der Test hat dann aber auch kein besseres Bild geliefert, Da muss man also noch üben :-)

Güße
Wolfgang

ach so, das Präparat ist der weiße Gänsfuß von Jörg Weiss



Bob

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #3 am: Oktober 10, 2019, 11:01:50 Vormittag »
Hallo Johannes,
danke für den Tipp!
Ich habe mir das Datenblatt mal angesehen. Spannenderweise bekommen die auch mit 4 LEDs die Lücke bei ca. 500nm nicht geschlossen, und das wäre ja ein interessanter Bereich für Anregungslicht. Ich muss mir die vorhandenen Filtersätze mal ansehen und dann überlegen, was man damit machen kann, und welche Beleuchtung dafür gut passen würde. Eine weiße LED möchte ich sowieso haben, vielleicht fange ich mit der einfach mal an. Dazu brauche ich dann eine kurz bauende Kollektoroptik, vielleicht sowas wie Peter Höbel hier:http://www.mikroskopie-ph.de/Fluoreszenz.html gezeigt hat. Nur der hatte mehr Platz nach hinten. Vielleicht muss ich da einen Umlenkspiegel verwenden, wie bei meinem provisorischen Aufbau.

@Wolfgang: Schön, dass Du auf den Zug mit aufpringst, da können wir uns vielleicht gegenseitig Anregungen geben. Es geht ja auch darum, interessante Kombinationen aus Optik und Objekt zu finden, die mit den vorhandenen Möglichkeiten umsetzbar sind. Meines Wissens ist Auflicht-Fluoreszenz der Durchlicht-Fluoreszenz überlegen, weil die obere Ebene des Objekts angeregt wird, und das Licht durch das Objekt nicht zerstreut und gedämpft wird. Ich habe einen Hinweis gefunden, dass geringe Beleuchtung ein Vorteil ist, weil es zu weniger Überstrahlungen käme. Dabei ist auch immer zu bdenken, dass sich Erfahrungen, die mit HBO gemacht wurden, nicht 1:1 auf LED übertragen lassen werden.

Viele Grüße,

Bob

reblaus

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #4 am: Oktober 10, 2019, 11:49:23 Vormittag »
Hallo -

da möchte ich Bob bestätigen:

Falls es nicht nur um interessante Farbspiele geht und man sich intensiver mit Fluoreszenz beschäftigen will, kommt man auch bei Verwendung farbiger LEDs nicht ohne Erregerfilter aus. Die Farbmaxima bei Farb-LEDs sind meist so breit, dass man für ein sauberes Fluoreszenzbild mit dem Sperrfilter unnötig weit in den langwelligen Bereich gehen muss und interessante Fluoreszenzfarben abschneidet.
Wenn man ohnehin filtert ist es dann einfacher eine starke weiße LED zu verwenden, da die Leistung der stärksten Farb-LEDs bei den einzelnen Wellenlängen auch nicht besser sind als bei einer einer kräftigen weißen (z.B. Cree XM-L).

Insofern ist halt der gute, alte HBO-Ozongenerator von Wolfgang immer noch überlegen, weil dieser auch noch UV mitliefert. Bei LED-Betrieb muss man dazu eine separate LED verwenden.

Viele Grüße

Rolf

Bob

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #5 am: Oktober 10, 2019, 14:40:15 Nachmittag »
da die Leistung der stärksten Farb-LEDs bei den einzelnen Wellenlängen auch nicht besser sind als bei einer einer kräftigen weißen (z.B. Cree XM-L).

Hallo Rolf,
danke, damit hast Du gleich meine nächste Frage beantwortet.
Eine weiße LED möchte ich sowieso haben, um mit einem Strahlteiler Auflicht machen zu können, dann deckt die ja alles ab, was ich machen möchte.

Der Stopfen, der die Öffnung für die Auflicht-Aperturblende verschließt, ist aus Bakelit. Das Zeug neigt wohl dazu, etwas zu wachsen. Aus 50mm wurden 50,1mm und der Stopfen war kaum noch herauszubekommen. ::)

Viele Grüße,

Bob

ortho.peter

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #6 am: Oktober 10, 2019, 18:25:15 Nachmittag »
Hallo,

dazu hätte ich jetzt auch einige Fragen. Offensichtlich bin
ich nicht der Einzige, der sich mit RGBW-LEDs beschäftigt.
Nur fehlt mir leider noch die Erfahrung am Mikroskop.

@Bob (bzw. eigentlich an Alle): Was bedeutet eigentlich
der Begriff "Grünlücke" oder anders gefragt welches "Grün"
wird den zur Anregung benötigt?

@Johannes: hast Du mit der Cree gearbeitet? Wie hell ist
das Teil wirklich? Kann man die LED auch für Phasenkontrast
und im Dunkelfeld benutzen?

@Rolf: Du schreibst "Falls es nicht nur um interessante
Farbspiele geht und man sich intensiver mit Fluoreszenz
beschäftigen will, kommt man auch bei Verwendung farbiger
LEDs nicht ohne Erregerfilter aus. Die Farbmaxima bei
Farb-LEDs sind meist so breit, dass man für ein sauberes
Fluoreszenzbild mit dem Sperrfilter unnötig weit in den
langwelligen Bereich gehen muss und interessante
Fluoreszenzfarben abschneidet."
Das Verstehe ich nicht so ganz. Könntest Du das an
einem Beispiel (zb. Blau- oder Grünanregung mit einer
Cree Color) verdeutlichen? Wenn ich mir das Datenblatt
ansehe und das Spektrum bei 80% betrachte, sind die ca
20nm breit. Wie schmal muss es dann eigentlich werden?

Viele Grüße
Peter


Ebenfalls gerne per Du

Bob

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #7 am: Oktober 10, 2019, 18:46:20 Nachmittag »
Hallo Peter,
die Lücke ist typischerweise bei weißen LEDs bei blau-grün, etwa 500nm.
Die Fluoreszenz-Emission ist immer langwelliger als die Anregung. Von daher sind im sichtbaren Spektrum eher die kürzeren Wellenlängen attraktiv, als die längeren. Und da ist dann eine Lücke mittendrin. Ob sie stört hängt natürlich von den genutzten Wellenlängen ab.
Die monochromatischen LEDs haben Spektren in Form von Zaubererhüten. Die Fluoreszenz ist ziemlich schwach. Wenn sie überlagert wird von einer Zaubererhut-Krempe im längerwelligen Bereich, leidet der Kontrast. Das könnte man nur verhindern, indem man den Sperrfilter entsprechend langwellig wählt, wodurch man aber wieder interessante Teile der Fluoreszens ausschließt.

Viele Grüße,

Bob
 

ortho.peter

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #8 am: Oktober 10, 2019, 19:20:02 Nachmittag »
Hallo Bob,

danke für die rasche Antwort.

> Die Fluoreszenz-Emission ist immer langwelliger als die Anregung.
> Von daher sind im sichtbaren Spektrum eher die kürzeren Wellenlängen
> attraktiv, als die längeren. Und da ist dann eine Lücke mittendrin.
> Ob sie stört hängt natürlich von den genutzten Wellenlängen ab.
Ich interpretiere das jetzt mal so: gewünscht wäre ein kontinuierliches
Spektrum zwischen 400 und 550nm damit man sich mit schmalbandigen
Filtern "etwas" heraus filtern kann, dass zum jeweiligen Farbstoff
optimal passt. Weil aber nur zwei relativ schmalbandige Peaks bei 450
und 520 vorhanden sind, spricht man von einer Lücke. - Ist das halbwegs
richtig?

Wie sieht das dann eigentlich bei Autofluoreszenz aus? Die ganze
Färberei klingt für mich recht kompliziert und teuer. Damit lass' ich
mir sicher noch ein paar Jahre Zeit, bis ich alles andere im Griff
habe. Aber einen Schnitt einfach mal anleuchten, Filter reinschieben
und gut ist's - das würde mich schon interessieren. Geht das auch
mit Lücke?

> Die Fluoreszenz ist ziemlich schwach.
Das klingt nicht berauschend :-(. Ist das eine Frage der Leistung
oder liegt es an der Farbe?

> Wenn sie überlagert wird von einer Zaubererhut-Krempe im längerwelligen
> Bereich, leidet der Kontrast. Das könnte man nur verhindern, indem man
> den Sperrfilter entsprechend langwellig wählt, wodurch man aber wieder
> interessante Teile der Fluoreszens ausschließt.
Und wenn man ein sehr schmalbandiges Anregungsfilter benutzt, kann das
Sperrfilter auch schmalbandig sein und man bekommt mehr Fluoreszenz. -
War es das, was Rolf gemeint hat?

Viele Grüße,
Peter
Ebenfalls gerne per Du

Bob

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #9 am: Oktober 10, 2019, 19:56:04 Nachmittag »
Hallo Bob,

danke für die rasche Antwort.

> Die Fluoreszenz-Emission ist immer langwelliger als die Anregung.
> Von daher sind im sichtbaren Spektrum eher die kürzeren Wellenlängen
> attraktiv, als die längeren. Und da ist dann eine Lücke mittendrin.
> Ob sie stört hängt natürlich von den genutzten Wellenlängen ab.
Ich interpretiere das jetzt mal so: gewünscht wäre ein kontinuierliches
Spektrum zwischen 400 und 550nm damit man sich mit schmalbandigen
Filtern "etwas" heraus filtern kann, dass zum jeweiligen Farbstoff
optimal passt. Weil aber nur zwei relativ schmalbandige Peaks bei 450
und 520 vorhanden sind, spricht man von einer Lücke. - Ist das halbwegs
richtig? Ja

Wie sieht das dann eigentlich bei Autofluoreszenz aus? Die ganze
Färberei klingt für mich recht kompliziert und teuer. Damit lass' ich
mir sicher noch ein paar Jahre Zeit, bis ich alles andere im Griff
habe. Aber einen Schnitt einfach mal anleuchten, Filter reinschieben
und gut ist's - das würde mich schon interessieren. Geht das auch
mit Lücke? Ja gucke mal da: http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanik/151.html

> Die Fluoreszenz ist ziemlich schwach.
Das klingt nicht berauschend :-(. Ist das eine Frage der Leistung
oder liegt es an der Farbe? Das ist, als wenn Du im Keller mit der Taschenlampe herumleuchtest, die Taschenlampe ist hell, die Reflektion nicht so sehr. Die Kamera sammelt das schon ein. Das Foto oben waren 2sec. Belichtungzeit bei ISO 800, 10er Objektiv

> Wenn sie überlagert wird von einer Zaubererhut-Krempe im längerwelligen
> Bereich, leidet der Kontrast. Das könnte man nur verhindern, indem man
> den Sperrfilter entsprechend langwellig wählt, wodurch man aber wieder
> interessante Teile der Fluoreszens ausschließt.
Und wenn man ein sehr schmalbandiges Anregungsfilter benutzt, kann das
Sperrfilter auch schmalbandig sein und man bekommt mehr Fluoreszenz. -
War es das, was Rolf gemeint hat? Das Anregungslicht wird auch zurückreflektiert, und darf nicht in den Wellenlängenebreich fallen, der durch das Sperrfilter hindurchgeht. Deshalb möchte man zumindest in Richtung längerer Wellen eine klare Abgrenzung

reblaus

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #10 am: Oktober 10, 2019, 20:23:06 Nachmittag »
Hallo Peter & Bob -

besser als Bob kann ich das auch nicht erklären - didaktisch besonders wertvoll ist hier sein Zauberhut (allerdings eher für H.P.-Kenner  ;D).

Man könnte den Begriff "Ein Bild bekommt man immer" noch erweitern auf "etwas das wie Fluoreszenz aussieht kriegt man immer". Dazu hier noch ein quantitatives Beispiel:
Die blaue Cree hat zwar ihr Datenblattmaximum bei 451 nm, sie strahlt aber auch bei 500 nm mit mehr als 1 % dieses Maximalwerts.
Wenn nun eine Substanz nach Anregung mit 451 nm (royal blue) eine Fluoreszenz von 500 nm (blaugrün) aussendet, würde diese von dem direkt reflektieren Licht überlagert, denn von diesem erscheinen selbst 1 % meist noch heller als eine durch Anregung entstandene Fluoreszenz. Eine solche im Bereich 500 nm würden also davon überdeckt. Wenn man nun ein Erregerfilter hat, das z.B. schon bei 470 nm vollständig sperrt, dann kann ein blaugrünes Leuchten eindeutig als Fluoreszenz definiert werden. Hat man dieses nicht muss man ein Sperrfilter verwenden, das erst ab z.B. 500 nm durchlässt und die Fluoreszenz mitsamt Anregerlicht sperrt.

Bei den üblichen botanischen Objekten, zumal gefärbten, stört das nicht, weil ja im grünen, gelben und roten Bereich meist noch genügend Fluoreszenz vorhanden ist, die das ästethische Empfiunden anregt. Wenn man aber unter "Auto"fluoreszenz nach einer bestimmten Substanz sucht, von der man weiß, dass sie bei 500 nm fluoresziert hat man kein Ergebnis.

Noch auffälliger ist das bei Fluoreszenzanregung durch eine UV-LED bei 365 nm. Diese leuchtet auch noch deutlich im sichbaren blauvioletten Bereich - und gerade dort fluoreszieren auch sehr interessante Substanzen (z.B. Stilbene) und diese würden ohne schmalbandiges Erregerfilter nicht erkannt.

Die schwache Fluoreszenzintensität ist eigentlich kein Problem, wenn sie nicht von Störlicht oder von der übermächtigen Fluoreszenz mancher Histofarbstoffe überdeckt wird.

Viele Grüße

Rolf

ortho.peter

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #11 am: Oktober 10, 2019, 20:58:25 Nachmittag »
Hallo Bob und Rolf,

@Bob:
> Ja gucke mal da: http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanik/151.html
Hmm - Lesestoff, der ist immer willkommen. Der Artikel sieht nach richtig
viel Arbeit aus. Werde mich mal in aller Ruhe durch die ganze Site lesen,
da gibts sicher noch einiges anderes.

> Das ist, als wenn Du im Keller mit der Taschenlampe herumleuchtest, die
> Taschenlampe ist hell, die Reflektion nicht so sehr.
Das würde dann auch bedeuten, viel (Leistung) hilft viel.

>  Das Foto oben waren 2sec. Belichtungzeit bei ISO 800, 10er Objektiv
Klingt schon besser :-). Ich nehme an Du meinst die ersten beiden Fotos (?) -
Ja, genau so stelle ich mir das auch vor. Wenn ich das mit einer LED erreichen
kann, bin ich mehr als zufrieden.
Im Artikel stand nur eine LED am Axio. Kannst Du etwas zum Licht (Stärke) sagen.

> ... und darf nicht in den Wellenlängenebreich fallen, der durch das Sperrfilter
> hindurchgeht.
Nun dafür sind ja die Einschubfilter in den Revolvern bzw. die Filterwürfel
im Ploemopak da - das ist soweit ja klar.

@Rolf:
Dass die Fluoreszenz so nah an der Anregung ist, wahr mir nicht klar. Ich
hab' zwar den (Wikipedia-)Artikel von Stokes und der Stokesverschiebung gelesen
aber die Frequenzablage nie durchrechnen können, weil ein Parameter fehlt.
Wundert mich auch, dass da mit den einfachen Einschubfiltern (eigentlich recht
simple Folien) für die Revolver am Ortholux überhaupt etwas geht.

So wie ich das jetzt sehe, scheint die Abstimmung LED mit Anregungs- und Sperrfilter
das Erfolgsgeheimnis zu sein. Da wartet noch viel Arbeit auf mich.

PS.: Wer ist H.P.?

Viele Grüße
Peter
Ebenfalls gerne per Du

reblaus

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #12 am: Oktober 10, 2019, 21:18:06 Nachmittag »
Hallo Peter -

da habe ich mich missverständlich ausgedrückt!
Das Emissionsmaximum kann sehr nahe am Anregungsmaximum liegen, aber auch sehr weit entfernt sein!
Schau mal hier in den Filter-Assistenten von Zeiss:

https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/shop/filterAssistant/dyes/

Entsprechend kann man Filterkombinationen sauteuer erwerben, die das alles berücksichtigen - spiele mal mit den Grafiken für die Filtersets im Filterassistenten ein wenig herum:

https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/shop/filterAssistant/filtersets/

Und denke dran - die Neupreise haben mit den Möglichkeiten für den Bastler nichts gemein.

Viele Grüße

Rolf

Bob

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #13 am: Oktober 10, 2019, 21:26:59 Nachmittag »
Hallo Peter,
von mir ist nur das Testfoto oben in diesem Thread, nicht der Artikel, den ich verlinkt habe.
Mein Foto habe ich mit einer 2-3 Watt LED beleuchtet.

Viele Grüße,

Bob

reblaus

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Re: Erster Versuch mit Auflicht-Fluoreszenz: Blattspitze Ficus quer mit Grünanregung
« Antwort #14 am: Oktober 10, 2019, 21:33:53 Nachmittag »
Nachtrag:

H.P. ist natürlich Harry Potter! Davor hatten die Zauberhüte bei uns Formen, welche die Emmission nicht gut beschrieben hätten   ;D