Autor Thema: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III  (Gelesen 2315 mal)

Siegfried

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #45 am: Oktober 30, 2019, 18:52:56 Nachmittag »
Hallo
Noch ein Versuch.
Diesmal habe ich von einer Roten Johannisbeere (Ribes rubrum) in unserem Garten einen Schnitt von einem Seitentrieb gemacht.
Der Schnitt ist mir zwar auch nicht besonders gelungen, aber beim Färben habe ich festgestellt(diesmal genau nach der Anleitung von Klaus), daß je nach Pflanze, ich meine zB. im Vergleich zum Efeu,  die Farben anders kommen.
Anbei 2 Foto's, (keine Schichtaufnahmen)
  Gruß von Siegfried
« Letzte Änderung: Oktober 30, 2019, 18:55:21 Nachmittag von Siegfried »

Peter G.

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #46 am: Oktober 31, 2019, 09:27:37 Vormittag »
Hallo,

mein halbwegs gelungener Färbungsversuch, den ich in #35 gezeigt hatte, war offensichtlich ein Zufallsergebnis. In vielen weiteren Versuchen mit dem Hartriegel konnte ich dieses Ergebnis nicht mehr reproduzieren. Ich habe mehr oder weniger verdünnt, konzentriert gefärbt, mehr oder weniger erhitzt, kalt gefärbt, die Färbezeiten verändert, differenziert oder darauf verzichtet... Bereits beim Spülen mit Wasser direkt nach der Färbung wurde viel Rot ausgezogen und im Verlauf der Weiterbehandlung verblasste es einfach.
Der Wechsel auf andere Sträucher (Kamelie, Rose, Weinrebe) erbrachte ebenfalls keine befriedigende Färbung. Alle zeigten ein eher gelblichbraunes Xylem, sehr ähnlich wie bei Siegfrieds Färbung (Rote Johannisbeere).

Viele Grüße
Peter G.

Bob

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #47 am: Oktober 31, 2019, 18:18:54 Nachmittag »
Hallo Siegfried,
der Schnitt sieht prima aus. Die Risse würde ich auf die Jahreszeit schieben, das gibt Dir ein halbes Jahr zum Üben. ;D
Das Periderm ganz außen würde vielleicht mit etwas weniger Farbe mehr Struktur erkennen lassen, das ist immer so ein Gratwanderung.

In Deinem ersten Bild durchdringt ganz unten etwas (grün gefärbtes) das Xylem - was mag das denn sein?

Viele Grüße,

Bob

Siegfried

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #48 am: November 01, 2019, 18:09:54 Nachmittag »
Hallo Bob
Erst mal Danke für deine Hinweise.
Auch wenn meine Schnitte noch nicht zu meiner vollen Zufriedenheit gelingen, mit deinem Messerhalter und Gegenstück läßt sichs prima arbeiten.
Ach ja, mein Handmikrotom hatte schon eine Befestigungseinrichtung für Tischmontage dabei.
Trotz der Jahreszeitlichen Zustände des Rohmaterials versuche ich weiter und auch beim Färben sind ja noch Abänderungen möglich.
Den grüne Einschluß beim 1. Foto, das muß ich ehrlich zugeben, ist noch eine Unsauberkeit vom Schneiden.
Ein anderer Schnitt war da sauberer, aber nicht dünn genug.
Da mir aber das Gezeigte besser zusagte, habe ich die Verunreinigung schlichtweg ignoriert.
Da muß ich noch genauer arbeiten.
  Grüße von Siegfried aus dem frostigen Hasenthal      -- letzte 2 Nächte bis minus 8Grad.

Bob

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #49 am: November 02, 2019, 08:49:05 Vormittag »
Hallo Siegfried,
ich hatte mich gefragt, ob der grüne Streifen eine Struktur im Schnitt aufzeigen würde, oder eine ehemalige Verletzung des Triebs.
Das Bild war es auf jeden Fall wert, gezeigt zu werden, daraus entsteht ja auch eine Motivation für sich selbst, es Schritt für Schritt noch besser zu machen.

Viele Grüße,

Bob

Fahrenheit

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #50 am: November 10, 2019, 09:04:47 Vormittag »
Liebe Pflanzenfreunde,

auch wenn der Thread schon fast tot ist: leider habe ich erst die Tage Zeit gefunden, anhand des Efeublattstiels (Hedera helix) ein paar Färbeversuche zu unternehmen. Hier möchte ich nun die W-Asim III Färbung von Klaus (die Chemie stammt aus dem gleiche Ansatz, der hier verwendet wurde) und die Variante von Rolf-Dieter zeigen, die in zwei Stufen gefärbt wird.
Vor den jeweiligen Aufnahmen findet Ihr das von mir verwendete Rezept.
Um es gleich vorweg zu nehmen: beide Varianten funktionieren bei mir einwandfrei (Klaus muss meines Erachtens also nicht neu kochen), unterscheiden sich aber in den Farbtönen ein wenig, was letztendlich Geschmackssache ist und keiner Wertung bedarf.
Sinn und Zweck der botanischen Färbungen ist es ja, die anatomischen Strukturen deutlich sichtbar zu machen und diese Vorgabe erfüllen alle mir zurzeit zugänglichen Mehrfachfärbungen und mit etwas Erfahrung auch der frische, ungefärbte Schnitt. Ebenfalls müssen wir beachten, dass unsere Proben nicht alle gleich sind. Die Pflanzen besitzen unterschiedliche Organe mit jeweils unterschiedlichen Zellen und Zellwandstrukturen und auch eine sehr unterschiedliche Physiologie, sodass auch die jeweiligen sekundären Pflanzenstoffe beim konkreten Ergebnis einer Färbung mitwirken. Von physikalischen Parametern wie Schnittdicke und Abweichungen im Rezept wie Fixierdauer, Alter der Probe etc. gar nicht zu reden.
Ein Vergleich der Färbungen macht also per se nur am gleichen Objekt Sinn. Nicht zu vergessen: auch die Aufbereitung der Bilder hat Einfluss auf das Endergebnis.
Zu guter Letzt ist da noch das Rhodamin B, mit dem wir nun langsam Erfahrungen sammeln. Es scheint bei stark lignifizierten Zellen (richtiges "Holz") tatsächlich nicht so prägnant zu färben, wie das Acridinrot. Sicher mit einer der Gründe, warum Robin sich seinerzeit für letzteres entschieden hat.
Zum Dezemberupdate gibt es dann auf der Webseite des MKB einen großen Färbungsvergleich. :)

Den Blattstiel vom Efeu (Hedera helix) habe ich frisch auf dem Tempelchen mit Leica 818 Klingen im SHK Halter geschnitten (ca. 50 µm) und für 3 Stunden in AFE fixiert und dann zwei mal mit Ethanol 70% gespült.
Leider ist der Blattstiel ein wenig zu dick, sodass die Übersichtsaufnahmen etwas beschnitten sind.


Beginnen wir mit der W-Asim III Färbung von Klaus, einer echten Simultanfärbung, die m.E. sehr einfach zu handhaben ist.

Hier mein Rezept:
  - Stufenweises Überführen der Schnitte aus Ethanol 70% in Aqua dest.
  - Färben mit W-Asim III (unverdünnte Originallösung von Klaus) für 15 Minuten mit einmaligem leichten Erwärmen bis kurz vor den Siedepunkt
  - Gründliches Spülen in Aqua dest.
  - Sanftes Differenzieren in Aqua dest. für ca. 1 Stunden (mehrfacher Wasserwechsel ...)
  - Entwässern in Isopropanol rein (3* im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
  - Eindecken in Euparal

Und hier die Ergebnisse:

Bild 1: Übersicht mit dem 5x NPlan


Bild 2: Ein Detail (Leitbündel) mit dem 20x PlanApo


Bild 3: Ein Nebenleitbündel im Blattstiel mit umgebenden Gewebe, aufgenommen mit dem 40x Plan Apo PH2 im Hellfeld


Bild 4: Wie wird die Cuticula angefärbt? - aufgenommen mit dem 40x Plan Apo PH2 im Hellfeld



Und nun die W-Asim III Variante von Rolf-Dieter in zwei Schritten sukzedan gefärbt

Hier mein Rezept:
  - Stufenweises Überführen der Schnitte aus Ethanol 70% in Aqua dest.
  - Färben mit Rhodamin B für ca. 20 Minuten
  - Gründliches Spülen mit Aqua dest.
  - Färben mit Alcianblau/Acriflavin für ca. 15 Minuten
  - Gründliches Spülen mit Aqua dest.
  - gemäß Vorschrift keine Differenzierung, es gehen keine Farbwolken ab
  - Entwässern in Isopropanol rein (3* im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
  - Eindecken in Euparal

Und die zugehörigen Aufnahmen:

Bild 5: Übersicht mit dem 5x NPlan


Bild 6: Ein Detail (Leitbündel) mit dem 20x PlanApo


Bild 7: Ein Nebenleitbündel im Blattstiel mit umgebenden Gewebe, aufgenommen mit dem 40x Plan Apo PH2 im Hellfeld


Bild 8: Wie wird die Cuticula angefärbt? - aufgenommen mit dem 40x Plan Apo PH2 im Hellfeld



Kurz zur Technik:
- Leica DMLS Stativ mit DMLB Ergo-Trinotubus,
- NPlan 5x
- Plan Apo 20x
- HCX PlanApo 40X PH2 im Hellfeld
- Kamera Panasonic GX7 am DMLB Trino ("Ofenrohr")
- Kamerasteuerung per Funk-Fernauslöser

Bildverarbeitung
- Alle Aufnahmen sind gestackt (Zerene Stacker)
- Manuelle Normalisierung (Einstellung des Schwarz- und Weißpunkts mit XNView)
  Hier war es nicht immer möglich, die selben Parameter zu verwenden, da die Bilder unterschiedlich hell sind.
- Optimierung mit Neat Image V8.3.1. 64 bit
- Putzen der Randflächen (sofern vorhanden) mit Photoshop Elements (Farbwert 245:245:245)
- Verkleinern der Bilder auf 1024er Auflösung mit XNView
 
Ich hoffe, der Beitrag kommt nicht zu spät und hilft dem einen oder anderen bei der Optimierung der eigenen Rezepte. Und natürlich freue auch ich mich immer über Anregung und Kritik.

Herzliche Grüße
Jörg
« Letzte Änderung: November 11, 2019, 08:15:20 Vormittag von Fahrenheit »
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Siegfried

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #51 am: November 10, 2019, 10:24:07 Vormittag »
Hallo Jörg
Ein hervorragender, für mich äußerst lehrreicher Beitrag.
Da ich mich auch schon an Hedera helix versucht hatte, werde ich mich jetzt an deinen Abläufen orientieren.
Nochmals Danke für die Veröffentlichung deiner Erfahrungen.
Schönen Sonntag wünscht Siegfried aus Thüringen

Klaus Herrmann

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #52 am: November 10, 2019, 10:47:35 Vormittag »
Lieber Jörg,
herzlichen Dank für diesen sorgfältig ausgearbeiteten Vergleich der Simultanfärbung zur Sukzedanfärbung. Eigentlich erstaunlich, dass die Rottöne so deutlich unterschiedlich herauskommen, aber wie du sagst: die gewünschte Farbkontrastierung ist in beiden Fällen gegeben. Es bleibt also nur dem Geschmack überlassen, was man lieber hat.

Die Simultanfärbung ist natürlich einfacher und schneller, aber wenn man es mehr fuchsinrot statt orange haben möchte geht es wohl nicht simultan.

Aber wer gerne die Einzelkomponenten haben möchte bekommt diese natürlich auch von mir, das ist kein Problem, weil ich die Farbansätze natürlich getrennt herstelle und erst die Lösungen mische.
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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Wutsdorff Peter

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #53 am: November 10, 2019, 11:50:55 Vormittag »
Hallo in die Runde der Färbespezialisten,
Klaus: nach Deiner Anweisung soll nach dem Färben und Spülen 10 Sek. mit Ethanol 100% das Rot verringert  werden. Das  geht bei mir nicht! das  Rot wird nach 2 - 3  Sek.mit Ethanol völlig gelöscht.
Meine sicherlich viel zu  dicken (gemessen mit der Mikrometerschraube ca.  0,1mm)  Schnitte sind nach dem Färben fast undurchsichtig. Wenn ich dann mit Ethanol und HCl differrenziere werden die Schnitte heller, aber das Rot ist weg.
Ich schneide kleine Zweige D=3-4 mm der Buche mit meinem Kosmos Tischmikrotom, unter Zu-Hile-Nahme der Vorrichtung von Bob zum "Gegenhalten" .
Jörg hat das Differenzieren mit Ethanol weggelassen.
Das nur 5 Min-Färben war auch nicht "dat jelbe von´s Ei"
Jetzt werde ich die zweite Methode von Jörg  probieren.
Bilder zeige ich erst, wenn  es einigermaßen akzeptabel ist.
Gruß Peter
 

Wutsdorff Peter

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #54 am: November 10, 2019, 19:01:43 Nachmittag »
Hallo KLaus,
ich bitte um Aclianblau/Acriflavin

gemäß Vorschlag von Jöeg
- Färben mit Aclianblau/Acriflavin für ca. 15 Minuten

Gruß Peter

Klaus Herrmann

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #55 am: November 10, 2019, 22:27:01 Nachmittag »
Hallo Peter,

mal abgesehen vom Tippfehler bei Jörg, den du übernommen hast (richtig ist Alcianblau) was willst du tatsächlich? Wenn ich dich richtig verstehe fehlt dir doch das Rot?
Und wenn ich Gemische herstellen soll, dann sollte ich eine Rezeptur haben.
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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Fahrenheit

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #56 am: November 11, 2019, 08:39:35 Vormittag »
Liebe Pflanzenfreunde,

danke Euch, es freut mich, dass ich etwas helfen konnte.

Der Schreibfehler ist korrigiert, es heißt nun Alcianblau, wie es sein muss.
Zu den Konzentrationen der Lösungen wird sich Rolf-Dieter vielleicht noch melden.
ansonsten wird man auch hier fündig:
http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanische_mikrotechnik/296.html

Lieber Peter,
bitte bedenke, dass die Anwendung des zweiten Rezepts für die Sukzedanfärbung bei anderen Proben durchaus anders ausfallen kann und wird.
Hier möchte ich empfehlen, zunächst das Probleme mit der Schnittdicke in den Griff zu bekommen (meine Schnitte mit 50 µm sind an sich schon sehr dick, viele Kollegen schneiden deutlich dünner) und dann statt mit Ethanol + HCL zu Differenzieren einfach Wasser zu verwenden und dieses länger einwirken zu lassen (sanfte Differenzierung).
Damit lässt sich der Farbauszug deutlich besser steuern. 
Das Differenzieren mit Salzsäurealkohol kenne ich ausschließlich im Zusammenhang mit einer Safranin-Vorfärbung bei der Müller SAC Färbung. Salzsäurealkohol ist mir persönlich viel zu heftig. Für mich ist es, als wollte ich eine Reisszwecke mit dem Vorschlaghammer einschlagen ... ;)

Allen herzliche Grüße
Jörg
« Letzte Änderung: November 12, 2019, 10:57:34 Vormittag von Fahrenheit »
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Wutsdorff Peter

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #57 am: November 11, 2019, 11:42:03 Vormittag »
Hallo Klaus und Jörg
vielen Dank  für Eue Hilfe.
Aclianblau/Acriflavin habe ich noch.
Es liegt offensichtlich an zu dicken Schnitten (Brotscheiben).
Bei weichen Stengeln vom Blumen sind die Schnitte dünn genug.
Bei hölzernen Stengeln klappt es trotz neuer Klinge  nicht so gut.
Ich erinnere mich, daß ein Kollege eine Methode zeigte, wie man Holz "weichkochen" kann.
Ich werde also weiter üben.
Also demnächst Fotos
Gruß Peter

Wutsdorff Peter

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #58 am: November 11, 2019, 11:47:48 Vormittag »
Nch was,
Klaus, Du hast geschrieben:
"Aber wer gerne die Einzelkomponenten haben möchte,  bekommt diese natürlich auch von mir, das ist kein Problem, weil ich die Farbansätze natürlich getrennt herstelle und erst die Lösungen mische."
Schicke mir  doch bitte die Einzelkomponenten mit einem Rezept dazu.
Vielen Dnak im Voraus
Peter

Klaus Herrmann

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Re: Mein erster Versuch mit Wacker ASim III
« Antwort #59 am: November 11, 2019, 11:59:03 Vormittag »
Hallo Peter,

die Einzelkomponenten Rhodamin B, Acriflavin und Alcianblau kannst du gerne haben. Bei der Färbevorschrift hältst du dich am Besten an die von Hans-Jürgen Koch, die er immer sehr sorgfältig in seinen vorbildlichen Beiträgen angibt.

Und Ethanol-Salzsäure ist wirklich ein Ratzeputz, ich habe das noch nie eingesetzt.

Nachtrag:Ich lese gerade: du hast ja Acriflavin und Alcianblau, dann brauchst du doch nur noch Rhodamin B.

Ich warte mal mit dem Verschicken, bis alles klar ist!
« Letzte Änderung: November 11, 2019, 12:40:10 Nachmittag von Klaus Herrmann »
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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