Autor Thema: Paraffintechnik in der Botanik  (Gelesen 498 mal)

Alf

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Paraffintechnik in der Botanik
« am: März 16, 2020, 21:31:26 Nachmittag »
Vorwort

Seit zwei Jahren beschäftige ich mich jetzt mit der Anfertigung botanischer Präparate. Und auch wenn man mit Handschnitten, und Handzylindermikrotom mit SHK-Klingenhalter bei gewissen Proben wunderbare Ergebnisse erhält, so gibt es zahlreiche Exemplare bei denen ich nie zufriedenstellende Resultate verbuchen konnte (was zum Teil sicher auch an meiner eher kurzen zweijährigen Erfahrung liegt). Da mein Hauptinteresse eigentlich der tierischen Histologie galt, war für mich immer klar, dass ich früher oder später Paraffinschnitte anfertigen möchte. Seit einem Jahr besitze ich ein Reichert-Rotationsmikrotom und habe viel Erfahrung gesammelt. Da die Botanik nicht weniger interessant ist und Proben für die Botanik auch wesentlich einfacher zu besorgen sind, musste ich die Paraffintechnik auch auf botanische Präparate anwenden.
Die Anfertigung botanischer Paraffinschnitte stellte mich aber vor neue Herausforderungen. Im Gegensatz zur tierischen Histologie musste man einige Prozesse anpassen und verfeinern. Nachdem ich jetzt seit 1 Jahr, so es meine Freizeit zulässt, ich daran arbeite qualitativ hochwertige Paraffinschnitte für botanische Proben anzufertigen, gelingt es mir mittlerweile ziemlich gut.
Deshalb möchte ich meine Methoden hier für jeden verständlich veröffentlichen und ihr/ihm hoffentlich etwas Arbeit ersparen und einen kleinen Leitfaden bieten. Die von mir genannten Methoden und Techniken basieren hauptsächlich auf meiner Erfahrung und können sicherlich teilweise noch verbessert werden, weshalb ich mich gerne über Anregungen und Rückmeldung freue.



Notwendigkeit und Machbarkeit von botanischen Paraffinschnitten

Natürlich kann man sich die Frage stellen, wofür man überhaupt Paraffinschnitte von botanischen Proben anfertigen möchte. Im Gegensatz zu tierischen Proben kommt man doch mit Handschnitten, Handmikrotomen und Modifikationen, wie der Möhren-Methode, doch recht weit. Und für eine Vielzahl an Präparaten ist diese Frage auch berechtigt. Für Pflanzenstängel, Blattstiele und viele andere Proben, die vor allem stabil eingespannt werden können und ein zusammenhängendes Gewebe sind, sodass sie beim Schneiden nicht zerfallen, ist eine Paraffineinbettung nicht nötig.
Trotzdem sind viele der Abbildungen in Büchern (Kremer z.B.) und der erwerbbaren Dauerpräparate höchster Güte (von Lieder z.B.) zum größten Teil keine Handschnitte. Da mich vor allem die Abbildungen im Kremer immer sehr beeindruckt haben und ich mit meinen Handschnitten nie diese Qualität erreicht habe, habe ich mich entschlossen es mit Paraffinschnitten zu versuchen. Es wird sicherlich viele geben, die sich wundern über den Aufwand den man betreibt, wenn man eigentlich auch gute Handschnitte anfertigen könnte.
Die folgenden Punkte stellen eine Auflistung an Überlegungen dar, anhand derer man abwägen kann (anhand derer ich abwäge), ob ich einen Paraffin-, oder Handschnitt anfertige.
Ein zweifelsohne wichtiges Kriterium eines gelungenen Schnittes, ist seine Dicke. Man darf nicht dem Irrglauben verfallen, dass ein Schnitt umso besser sei, je dünner er gelingt. Einen Pflanzenstängel, Ast, Wurzelquerschnitt, etc. 5 µm dünn zu schneiden ist weder notwendig noch besonders ansehnlich, da der dreidimensionale Aufbau nicht gut abgebildet wird, die Färbung wesentlich schwächer ausfällt und darunter Ästhetik und vor allem Informationsgehalt leiden. Deshalb ist es wichtig für jede Probe die Dicke individuell zu wählen. Möchte man hingegen einen Längsschnitt durch eine Zwiebelwurzel anfertigen, um Mitosefiguren abzubilden, kommt man mit einem Handschnitt nicht weit und Schnittdicken jenseits der 10 µm werden zu weniger zufriedenstellenden Resultaten führen. Deshalb ist es nicht notwendig gut schneidbare Proben in Paraffin einzubetten, wenn der Handschnitt genauso gute Ergebnisse liefert.
Ein Mikrotom schnitt liefert Präparate gleichbleibender Dicke, während Handschnitte oft auskeilen. Für das Studium des Aufbaus ist ein Auskeilen aber nicht schlecht zu werten, so kann man auf der einen Seite mehr Information über den räumlichen Aufbau erhalten und auf der anderen Seite die Zellen besser an sich betrachten. Ein gleichmäßig dünner Schnitt ist dafür „schöner“.
Ebenfalls zu beachten gilt die Stabilität der Probe. So kann man z. B. einen stabilen Blattstängel ohne weiteres am Handmikrotom schneiden, den Stängel eines Löwenzahns oder eine Knospe wird per Handschnitt kaum zu guten Dauerpräparaten führen. Auch sehr kleine Proben, wie z. B. Moose, Blattquerschnitte dünner Blätter etc. sind per Hand oft schwer zu verarbeiten. Darin liegt ein großer Vorteil der Paraffintechnik, die es gestattet auch sehr kleine Proben wunderbar zu schneiden.
Ein weiterer Punkt, der bei botanischen Proben ins Gewicht fällt, ist das Ausmaß der Verholzung. Je verholzter eine Probe ist, desto härter wird sie während des Entwässerns und desto schwieriger wird der Schnitt. Harte und stark verholzte Proben lassen oft keinen guten Schnitt zu, da sie beim Schneiden in Paraffin regelrecht zerbröseln. Bei solchen Proben empfehle ich tendenziell größere Probenquerschnitte von z. B. Ästen zu verwenden, so erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass ein Teil des Schnittes gelingt und brauchbar ist. Auch gelingen Längsschnitte von Ästen nach meinem Gefühl tendenziell besser als Querschnitte bei Paraffin eingebetteten Proben. Das liegt eventuell daran, dass die Klinge beim Querschnitt ständig durch Gewebe unterschiedlicher Härte gleitet, während sie beim Längsschnitt konstant in ihrem Gewebe schneidet.
Bei derart harten Proben ist auch ein Handschnitt nicht einfach, aber wahrscheinlich etwas besser durchzuführen. Da dieses Problem ohnedies hauptsächlich auch Äste von Bäumen zutrifft, greif man eventuell ohnedies gleich zum Handmikrotom.



Materialien und Gerätschaften

Das Anfertigen von Paraffinschnitten erfordert wesentlich mehr Gerätschaften und Verbrauchsmaterialien als das Schneiden am Handzylindermikrotom.
Man benötigt ein Mikrotom, vorzugsweise ein Schlittenmikrotom, da ein ziehender Schnitt bei verholzten Proben von Vorteil ist. Ich arbeite mit einem Rotationsmikrotom und auch damit lassen sich problemlos Schnitte anfertigen. Es ist immer besser ein gebrauchtes Markenmikrotom zu kaufen, als ein billiges „Chinaprodukt“.
Zum Schmelzen von Paraffin benötigt man einen Wärmschrank. Ich benutze einen Melag Incubat, der nicht mehr als 65°C schafft, was aber völlig ausreicht, um Paraffin zu schmelzen. Außerdem sind diese Wärmeschränke ziemlich kostengünstig und decken eigentlich so ziemlich alle Anwendungen im Bereich Mikroskopie ab (Aushärten von Eindeckmittel, bebrüten von Agarplatten, …).
Eine Wasserstrahlpumpe ist sehr hilfreich, um Luftbläschen aus den Proben zu entfernen, was ein essenzieller Schritt ist, da sonst keine einwandfreie Einbettung gewährleistet ist. Es gibt sehr preisgünstige Modelle aus Kunststoff. An dieser Stelle ein kleines Wort der Warnung zum Umgang mit Vakuum. Es dürfen nur vakuumfeste Gefäße (alle runden Gefäße, wie Rundkolben), oder dickwandige erprobte Gefäße (viele Reagenzgläser) verwendet werden. Im Zweifelsfall sollte man testen, ob die Gefäße das Vakuum tolerieren. Dazu legt man ein Vakuum an das Gefäß an und deckt es dabei mit einem Handtuch ab und wartet mindestens 5 Minuten, ob es implodiert. Beim Arbeiten mit Vakuum muss ausnahmslos eine Schutzbrille getragen werden, eine Implosion ist genauso gefährlich wie eine Explosion.
Eine Wasserstrahlpumpe arbeitet umso stärker, je kälter das Wasser ist mit der man sie betreibt. Das Endvakuum wird durch den Dampfdruck des Wassers bestimmt und der nimmt mit der Temperatur ab.
An Verbrauchsmaterialien benötigt man Ethanol 96% (Brennspiritus aus dem Baumarkt), Isopropanol, n-Butanol, Xylol, Paraffin. Die Lösungsmittel sind alle entflammbar. Xylol ist gesundheitsschädlich, aber keinesfalls giftig. Trotzdem sollte man ein Einatmen der Dämpfe vermeiden, weshalb man zumindest das Fenster öffnen sollte.



Durchführung

Der erste Schritt besteht darin eine geeignete Probe auszuwählen. Diese sollten nicht zu groß gewählt sein. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Probe kann man größere und kleinere Proben auswählen. Als ungefähre Faustregel gilt, je härter und verholzter das Material, desto kleiner sollten die Proben sein. Weiche, verformbare Pflanzenstängel können einen größeren Durchmesser haben, da sie eine wesentlich bessere Schneidbarkeit haben und nicht so spröde werden, wie verholzte Proben.
Danach beginnt man mit der AFE Fixierung. Sollte man die Probe beim Spazierengehen entnehmen, so kann man die Probe danach noch auf die gewünschte Größe zuschneiden, oder man schneidet sofort zu. Es empfiehlt sich die größeren Proben gleich so zuzuschneiden, wie sie später eingebettet werden. Man bettet natürlich nicht einen ganzen Ast ein, sondern nur eine maximal einen halben Zentimeter dicke Scheibe ein, je dünner desto besser funktioniert die Einbettung. Ein halber Zentimeter dicke funktioniert bei mir aber immer gut.
Nach dem Fixieren überführt man die Probe in einen Rundkolben (oder in ein anderes vakuumfestes Gefäß) und bedeckt sie mit ausreichend 50% Ethanol. Danach legt man mit einer Wasserstrahlpumpe ein Vakuum an, wobei sofort die Luft aus den Schnitten entweicht und das Ethanol aufgrund des geringen Druckes auch zu sieden beginnt. Nach kurzer Zeit beruhigt sich die Blasenbildung und man lässt noch 2 Minuten die Wasserstrahlpumpe arbeiten, danach sollte sämtliche Luft entfernt sein.
Jetzt beginnt man mit der Entwässerung der Proben. Dafür werden die Proben aus dem Rundkolben direkt in 50% Ethanol überführt.

Von jetzt an möchte ich 2 Methoden vorstellen.

a)   Bei Zimmertemperatur:
die Proben werden alle 12 Stunden durch folgende Stufen transferiert, 50% Ethanol, 70% Ethanol, 96% Ethanol, 96% Ethanol, 100% Isopropanol, 100% Isopropanol, 100% n-Butanol, Paraffin I, Paraffin II. Die Paraffin Schritte erfolgen natürlich im Wärmeschrank bei 65°C. Am Ende darf kein Butanol Geruch mehr wahrnehmbar sein (Anm.: man kann vermutlich auf Butanol verzichten).

b)   Im Wärmeschrank:
die Proben werden durch dieselben Alkoholstufen geschickt, aber bei 65°C, dadurch kann man jeden Schritt auf 2 Stunden reduzieren. Erst ab Isopropanol, wenn man um 8 Uhr beginnt ist das um 16 Uhr, sollte man jeweils 3 Stunden bei 65°C anwenden, oder dann auch über Nacht, damit eine vollständige Entwässerung sichergestellt ist. Die beiden Paraffinschritte sollten wieder je 12 Stunden dauern.
Auf keinen Fall dürfen Alkoholdämpfe in den Wärmschrank entweiche, da dieser sonst explodieren könnte, weshalb man die Alkoholgefäße in ein größeres, luftdichtes Gefäß stellt. Anfangs baut sich ein gewisser (geringer) Druck auf, den man ausgleichen sollte.

Danach werden die Proben ausgegossen, wofür ich eine Streichholzschachtel mit Backpapier auslege. Die Proben sollten entsprechend orientiert werden, man muss also warten bis das Paraffin eine gewisse Festigkeit erreich, sodass z.B. Pflanzenstängel nicht mehr umfallen. Sobald die Proben stabil stehen stellt man die Schachtel in den Kühlschrank. Ich bette in derselben Schachtel meist gleich mehrere Proben ein. Sobald das Paraffin erstarrt, aber noch nicht ganz fest ist, zerteilt man den großen Paraffinblock in kleinere, sodass jede Probe in einem eigenen Block liegt. Man sollte die Blöcke schon so zuschneiden, sodass möglichst wenig unnötiges Paraffin rund um die Probe ist. Danach legt man die Blöckchen wieder in den Kühlschrank und lässt sie gänzlich aushärten.
Jetzt kann man die Blöckchen auf das Mikrotom aufschmelzen und Schneiden. Man sollte auf die Orientierung der Proben achten. Asymmetrische proben sollten so positioniert werden, dass die Längsachse der Probe normal zur Mikrotomklinge steht. Die Inklination der Mikrotomklinge sollte möglichst steil sein, ca. 5°. Danach kann mit dem Schneiden begonnen werden, wobei man mit großer Schnittdicke zuschneidet und dann auf die gewünschte Schnittdicke dünner stellt. Man sollte versuchen Schnittbänder zu erhalten.
Die Schnitte werden sofort in ca. 42°C warmes Wasser übertragen, mit der glänzenden Seite Richtung Wasser, wodurch sie sich strecken. Das Strecken sollte ungefähr 1 Minute erfolgen. Sollten sich die Schnitte nicht ganz strecken und die Schnitte gewellt sein, so kann man die Temperatur am Wasserbad hinaufdrehen bis sich die Schnitte schön glatt strecken. Keinesfalls darf das Paraffin hier schmelzen, da sonst die Proben meistens zerreißen. Vor allem verholzte Schnitte strecken sich oft nicht schön und man muss kleinere wellen in Kauf nehmen.
Sobald die Schnitte auf einen sauberen Objektträger aufgezogen sind lässt man sie mindestens eine Stunde lufttrocknen. Damit die Schnitte später beim Färben nicht abschwimmen kann man die Objektträger vorher mit einer dünnen Schicht Glycerin Gelatine bestreichen, was aber bei der Färbung zu störenden Verfärbungen am Objektträger führt. Deshalb nehme ich den Objektträger, sobald die Schnitte darauf getrocknet sind und lege den Objektträger mit der den Schnitten nach oben auf eine heiße Wärmplatte, wodurch dass Paraffin schmilzt. Er wird solange draufgelegt, bis Rauch aufsteigt, man kann das Paraffin wegblasen. Dadurch werden die Schnitte wirklich gut befestigt und es gibt später keine Farbstoffniederschläge.
Danach lässt man ein bisschen abkühlen, stellt den Objektträger aber dann noch warm – leicht heiß in Xylol, wodurch das Paraffin sofort entfernt wird. Danach wässert man die Schnitte je 5 Minuten in folgenden Stufen: Xylol, n-Butanol, Isopropanol, 96% Ethanol, 50% Ethanol. Danach kann man gleich färben. Entweder die wässrige FAC n. Petzold direkt drauftropfen, oder eine Hämatoxylin-Eosin Färbung durchführen.
Bei der FAC Färbung n. Etzold lässt man die Lösung einfach auf den Schnitten für 10 Minuten einwirken. Danach spült man für 2 Minuten direkt mit 100% Isopropanol ab, wodurch meist eine ausreichend gute Differenzierung erreicht werden kann. Falls die Differenzierung nicht gut genug ausfällt, kann man mit 90% Ethanol entfärben und dann gleich mit Isopropanol abspülen, da andernfalls das Fuchsin zu sehr ausgezogen werden würde. Danach entwässert man wieder jeweils zu 5 Minuten in Isopropanol, n-Butanol, und 2-mal Xylol. Danach deckt man mit Malinol ein.



Probleme

Das häufigste Problem sind spröde und zerbröselnde Schnitte beim Schneiden. Der Hauptgrund dafür liegt daran, dass die Probe dann zu verholzt ist und man wahrscheinlich keine Paraffinschnitte anfertigen kann. Sollte dieses Problem bei einer eigentlich gut schneidbaren Probe auftreten, so liegt es meist an einer ungenügenden Entwässerung.



Resümee / Diskussion

Mit der dargestellten Technik erhalte ich meisten sehr zufriedenstellende Resultate und die Methoden sind auch nicht allzu schwer. Das Schneiden am Rotationsmikrotom muss natürlich genau wie das Anfertigen von Handschnitten gelernt werden.
Für mich ist die Paraffintechnik auch in der Botanik sehr wertvoll, da sie für mich bessere Ergebnisse liefert, vor allem in Bezug auf Blattquerschnitte, Knospen, Blüten, Wurzeln, etc. Der Nachteil liegt vor allem in den Anschaffungskosten für ein gutes Mikrotom (obwohl gebrauchte, gut erhaltene Markenmikrotome wie meines ab und an im Forum zu erwerben sind und das auch erschwinglich) und die Wartungs- und Verbrauchsmaterialkosten.
Jeder der diese Technik einmal erlernt hat wird allerdings mit sehr schönen Präparaten belohnt und es gibt kaum Präparate, die sich nicht anfertigen lassen. Man sollte aber für jedes Präparat abwägen, ob ein paraffinschnitt dafürsteht. Die zahlreichen Beiträge diverser Forenmitglieder zeigen Hand- und Handmikrotomschnitte von Ästen und Stängeln, die man auch als Paraffinschnitt nicht besser hinbekommen würde.



Beispiel eines Präparates, das man ohne Paraffin nicht herstellen könnte, da es zerfallen würde. Es handelt sich um eine teilweise durchaus verholzte und harte Probe, die nach obigem Protokoll eingebettet und problemlos 5 Mikrometer geschnitten wurde.






jako_66

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Re: Paraffintechnik in der Botanik
« Antwort #1 am: März 16, 2020, 21:47:53 Nachmittag »
Hallo Alf,

sehr schöne Zusammenstellung, DANKE! Das erleichtert vielen vielleicht den Einstieg in diese spannende Präparationstechnik! Dein Tipp mit dem Vakuum werde ich auch einmal probieren. Auch für den Hinweis mit dem Schnitt-Aufkleben & Paraffin "sublimieren" bin ich Dir sehr dankbar! Es schwimmt doch der eine oder andere Schnitt weg...

n-Butanol ist vielleicht auch durch Terpineol ersetzbar. Gibt es bei Kremer Pigmente noch recht günstig zu kaufen. Butanol ist dem Hausfrieden ja eher abträglich.
Zerbröselnde Schnitte kenne ich leider auch gut. Hinterher hat das Messer wieder schöne Scharten...

Viele Grüße

Sven
« Letzte Änderung: März 19, 2020, 12:22:47 Nachmittag von jako_66 »

David 15

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Re: Paraffintechnik in der Botanik
« Antwort #2 am: März 18, 2020, 20:24:21 Nachmittag »
Hallo Alf,

vielen Dank für deine schöne Zusammenfassung ! Es ist für mich immer interessant zu sehen wie andere die Paraffineinbettung angehen. In diesem Zusammenhang möchte ich ein paar Fragen loswerden:

So wie ich das verstehe gibt es keine Zwischenstufe mit 50% n-Butanol / 50% Paraffin wie ich es von der direkten Einbettung über Isopropanol her kenne ? Sind die Schritte Praffin I und II also lediglich dafür da, das restliche Butanol zu entfernen ?

Vielleicht noch als kleinen Tipp für diejenigen die selbst mal Hand anlegen wollen: Anstelle des Wärmeschrankes eignen sich auch ideal Babyflaschenwärmer für das schmelzen des Paraffins. Noch günstiger und definitiv platzsparender  ;)

Viele Grüße
David
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Fahrenheit

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Re: Paraffintechnik in der Botanik
« Antwort #3 am: März 19, 2020, 08:04:04 Vormittag »
Lieber Alf,

danke für die ausführliche Darstellung Deiner Methode! Wie bei Ronald: von solchen Beiträgen lebt das Forum.

Herzliche GRüße
Jörg
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Arbeitsmikroskop: Leica DMLS
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Bob

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Re: Paraffintechnik in der Botanik
« Antwort #4 am: März 19, 2020, 10:34:15 Vormittag »
Hallo Alf,
danke für das Vorstellen Deiner Methode!
Das ganze erscheint ja zunächst unübersehbar kompliziert, aber wenn man sich für jeden Schritt eine praktische Lösung gesucht hat, kann man das durchaus zu Hause machen.
Mein Aufbau funktioniert auch gut und ist sehr kompakt, kostengünstig und geruchsarm, ich möchte damit aber noch etwas mehr Erfahrung sammeln, bevor ich ihn hier vorstelle.

Zum Schmelzen und Infiltrieren nehme ich einen Kochtopf aus Aluguss, dem ich mit temperaturbeständigem Silikon einen ganz ebenen Boden verpasst habe. Außenrum ist er mit selbstklebendem Armaflex wärmegedämmt, Der steht auf der PID-geregelten Heizplatte, die ich hier mal vorgestellt hatte. Die Luft darin wälze ich mit einem PC-Lüfter um, damit die Wärmeverteilung weiter verbessert wird.

Zur Temperaturführung: Wenn man Paraplast Plus verwendet (mit DMSO zur schnelleren Infiltrierung), darf man 61° nicht überschreiten. Das Temperaturfenster, in dem man arbeiten kann ist dadurch klein und man braucht eine Wärmequelle die aus allen Richtungen wärmt und sehr genau geregelt ist.

Viele Grüße,

Bob

Alf

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Re: Paraffintechnik in der Botanik
« Antwort #5 am: März 19, 2020, 11:44:39 Vormittag »
Vielen Dank allseits für das Lob!


Zitat
n-Butanol ist vielleicht auch durch Terpineol ersetzbar.
Theoretisch ist es das, der Vorteil am Butanol ist aber, dass er verdunstet und dadurch das Paraffin meines Erachtens, besser in das Gewebe eindringt.


Zitat
So wie ich das verstehe gibt es keine Zwischenstufe mit 50% n-Butanol / 50% Paraffin wie ich es von der direkten Einbettung über Isopropanol her kenne ? Sind die Schritte Praffin I und II also lediglich dafür da, das restliche Butanol zu entfernen ?
Diese Zwischenstufe habe ich anfänglich verwendet und später weggelassen ohne dass ich einen qualitativen Unterschied in der Einbettung bemerkt habe. Ich habe mir dadurch das Arbeiten mit warmem Butanol erspart.


Die Methode mit dem Flaschenwärmer ist auf jeden Fall auch eine klasse Idee, gibt es hierzu eine genaue Anleitung?


LG,
Alf

Mikrotom

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Re: Paraffintechnik in der Botanik
« Antwort #6 am: März 26, 2020, 17:11:05 Nachmittag »
Danke,
eine sehr gute Anleitung. Ich verfahre ebenso, verwende aber anstatt n-Butanol lieber Chloroform (aus der Histologie) und beginne im Heizblock mit einer Mischung Chloroform-Paraffin  50% : 50%. Mit einer Schnittdicke von 15 - 20 Mikrometer gelingen sehr gute Präparate, auch von Knospen, wenn sie vorher ausreichend entlüftet waren.
Gruß Martin