Frage zur Gefriersubstitution

[bernd552]

Hallo in die Runde,

ich würde gerne die Gefriersubstitution mit Kleinsttieren bis (ca. 1-2 mm) versuchen, dabei würde mich interessieren, ob es bei chitinhaltigen Schalen in vertretbaren Zeiten überhaupt geht?
Hat das jemand mal versucht oder kennt jemand passende Links?

In beiden Suchfunktionen gibt es leider 0 Treffer und im Netzt wurde ich nicht fündig.

LG
Bernd

[Detlef Kramer]

Lieber Bernd,

wahrscheinlich kann ich Dir nicht helfen, ich habe das nie selbst gemacht. Aber ich denke, dass das schon gehen sollte, allerdings sehr langsam. Damit Mitleser verstehen, um was es geht: man schockgefriert die Objekte ohne vorherige chemische Fixierung und ersetzt dann das Wasser durch ein organisches Lösungsmittel. Eigentlich nur erforderlich, wenn man Schnitte anfertigen möchte.Wir können das gerne diskutieren, dann müsste ich wissen, was Deine konkrete Fragestellung ist.

Herzliche Grüße
Detlef

[Rene]

Hi Bernd, proper Gefriersubstitution by simple means (shooting in liquid propane) only gives  an artefact free layer of about 20 um max. Thicker stuff can be frozen in a vitreous state, but only under very high pressure. But as already remarked by Detlef, this is sample preparation for TEM, it might be a lot simpler for SEM. But why gefriersubstitution if you can dry it by freezedrying instead of substitution?

Best wishes, René

[Lungu]

Hallo Bernd,

als ich noch aktiv Aquarien hatte, gab es gefriergetrocknete Wasserflöhe. Ich habe mir die nie unter dem Mikroskop angeschaut, die kosten nur wenige Cent und wären sicher mal einen Versuch wert, bevor man größeren Aufwand treibt.

[reblaus]

Hallo Bernd -

leider habe ich nur Erfahrung mit der SEM-Präparation von Pflanzenteilen, z.B. pilzinfizierten Blättern o.ä.
Am wenigsten Artefakte erhielten wir nicht etwa mit der Kritischpunktttrocknung sondern viel simpler: Durch Kühlung mit flüssigem Stickstoff wurde aus Isopropanol eine Art Schlicker hergestellt in dem die Objekte versenkt wurden. Durch den hohen Siedepunkt des Isoprops wird eine Dampfbildung vermieden und durch den relativ schnellen Wärmeübergang im flüssigen Isoprop eine sehr schnelle und in unserem Fall artefaktarme Abkühlung erreicht. Danach wurde das ganze gefriergetrocknet und gesputtert. Feine Details sind mir leider nicht mehr im Gedächtnis.

Viele Grüße

Rolf

[wilfried48]

Hallo Rolf,

du meinst sicher das Schockgefrieren der Proben in flüssigem Propan (nicht Isopropanol), das mit flüssigem Stickstoff auf ca. -160 °C heruntergekühlt wurde.
So eine Einfriereinrichtung kann man sich leicht selber herstellen indem man ein kleines Duran Bechergläschen an einem Drahtgestell in ein N2 Dewar Gefäss hängt und nach dem Herunterkühlen von oben Propangas aus der Flasche in das Bechergläschen leitet, das gefriert dann im Becherglas. Kurz vor dem Schockgefrieren wird in das gefrorene Propan mit einem
Kupferstsab gerade soviel Wärme eingeleitet, dass es gerade flüssig wird.

Wenn die Probendicken kleiner 1mm sind, ist das sicher artefaktfreier als die Kritische Punkttrocknung die dafür bei grösseren Proben besser geeignet ist.

viele Grüsse
Wilfried

[Stephan Hiller]

Hallo,
flüssiges Propan zu hantieren ist nicht ganz ungefährlich (Explosionsgefahr).
Falls man flüssigen Stickstoff und einen Exsikkator zur Verfügung hat kann man den Flüssigstickstoff in einem Dewargefäß (es genügt ein einfacher Styroporbecher) im Exsikkator evakuieren bis er zu kochen beginnt und dann schneeförmig wird. Er geht unter mäßigem Vakuum (~ 10E-1 bis 10E-2 mbar) in die feste Form (N2 Schnee) über. Die Aggregatsänderung ist interessant zu beobachten, weil der Stickstoff dann mehrere Male noch unter einem "Blobb Geräusch" aufbricht wenn er schon gefroren ist. Belüftet man dann wieder, wird der Stickstoff sulzig (ähnlich wie tauender Schnee) ist aber immer noch "unterkühlt". In dieser Phase, die eine Weile andauert bevor er wieder vollständig verflüssigt, zeigt der Stickstoff kein "Leidenfrostsches Phänomen" mehr wenn man das zu gefrierende Material eintaucht. Ohne isolierende Gasblasen zu bilden friert die Probe sofort durch. 
Dieses Verfahren nutzt man in der Cryo Elektronenmikrokopie (SEM) durchaus auch für größere Objekte (Blattstücke, Wurzelstückchen , ...) um sie danach im SEM im vitrifizierten Zustand aufzubrechen, zu betrachten und ggf sogar mit der FIB zu schneiden und weiter zu präparieren und abzubilden.
Ein Link zu einer Präparationsanlage der Firma Quorum für das SEM (PP3010T) in der dieses Verfahren benutzt wird und auch näher beschrieben ist findet sich hier . Im zweiten Video etwas weiter unten wird das Einfrieren in N2 Slush eines kleinen Blattstücks gezeigt.

Man muss sich dazu natürlich nicht so eine Anlage kaufen. Die oben von mir genannten einfachen Gerätschaften reichen aus um "N2 Slushing" wie dieser Vorgang in der Fachsprache genannt wird durchzuführen.



Mit frostigen Grüßen

Stephan Hiller

[bernd552]

Hallo in die Runde,

danke erstmal für die Antworten.

Die Gefriersubstitution will ich für mein Langzeitprojekt "Herstellung von 3D Hologrammen von Mikroorganismen" versuchen, es ist also keine Präparation für das REM.

Ich habe mir aktuell eine Mikrofräse fertiggebaut (ein motorisch schwenkbarer Pollierfräserstift der von einer Dental-Turbine angetrieben wird, beides auf dem Mikroskoptisch montiert), ähnlich wie in https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35057.0 die automatisch unter dem Mikroskop eine dünne Schicht des in Wasser eingefrorenen Objektes wegfräßt und dann fotografiert, eine Tomografiesoftware soll die 3D Rekonstruktion übernehmen.

Falls bei der obigen Methode beim Fräßabtrag Hohlräume der Objekte kollabieren sollten, suche ich als Plan B nach einer Schnellmethode, um diese mit niederviskosen Kunststoff oder ähnlichem zu füllen, ohne dass das Objekt dabei die beim Tiefgefrieren fixierte, natürliche Position verliert (was bei einer üblichen Entwässerung in der flüssigen Phase über Lösungsmittelreihen geschehen würde).

Evtl. fällt jemanden aus der "Histologiefraktion" eine bessere Methode ein?

LG
Bernd

[Rene]

Keine bessere Methode Bernd, looking forwards to your results.
Embedding could work fine for your goal. I've seen freezesubstituted pollentubes being embedded in LR-White and polymerized at -20^oC. As substitution medium aceton was used, with some additives (uranyl or ruthenium, as far as I can remember).

Good luck, René

[bernd552]

Hallo Rene,

den Ansatz, niederviskose Methacrylate bei Minusgraden zu polymerisieren, finde ich sehr interessant! Da bleibe ich mal dran.

LG
Bernd