Autor Thema: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten  (Gelesen 413 mal)

güntherdorn

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milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« am: Mai 21, 2020, 21:39:17 Nachmittag »
hallo forianer,

ich möchte gefärbte dauerpräparate von fett-haltigen objekten wie z.b. milch herstellen,
ohne dass die für mich nur interessanten bakterien beim präparieren weggeschwemmt werden.
wenn ich nur lufttrockne und färbe, überdecken die massiv gefärbten fett-klexe die ganzen bakterien.
es geht auch um pilze und hefen in fetthaltigen produkten.
gibts eine lösung?

güntherdorn
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Klaus Herrmann

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #1 am: Mai 21, 2020, 23:35:49 Nachmittag »
Hallo Günter, das ist eigentlich ganz einfach:

http://www.laborundmore.com/archive/515406/Schneller-Nachweis-von-Krankheitserregern-in-Milcherzeugnissen.html

Für ein modern ausgestattetes Labor. ;D
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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SimonsToaster

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #2 am: Mai 22, 2020, 01:11:55 Vormittag »
Soweit ich weiß ist Milch mikroskopieren ein Anspruchsvolles unterfangen. Für den quantitativen Nachweiß von Zellen gibt es unter anderem die Methode nach Prescot und Breed. Die streichen ein sehr kleines Volumen aus, entfetten mit Xylol, fixieren dann mit Alkohol, färben mit Methylenblau und Zählen dann aus. Das genaue Verfahren wirst du hier finden:

Prescott, S. C. u. Breed, R. S.: The Determination of the Number of Body Cells in Milk by a Direct Method. Journal of Infectious Diseases 7 (1910) 5, S. 632–640

Sind zwar Zellen und nicht Bakterien, aber es gibt auch eine allgemeineren Einblick in die Mikroskopie von Milch. Weiß nicht ob es dir was nützt. Wenn du Probleme hast kann ich dir obige Literatur wohl auch besorgen.

Simon

güntherdorn

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #3 am: Mai 22, 2020, 09:25:49 Vormittag »
ich danke erstmal euch beiden für die antwort!

klaus,
eine anreicherung auf (leider oft speziellen, hochselektiven) nährböden ist mir bekannt.
ich will aber nur auf einem OT mit ausstrich einen überblick ALLER keime z.b. in milch sehen.
ich möchte in ausstrichen das grobe verhältnis (eppendorf-pipettierten) volumen zur keimzahl
testen. im frischen zustand isses wegen der vielen, störenden fett-tröpfchen in der OT-zählkammer
(auch nach leichter anfärbung) nicht prüfbar.

simon,
hatte schon viele versuche mit 50°C-lufttrocknung und xylol+alk versucht, doch festgestellt,
dass sehr viele keime (selbst bei vorsichtigem spühlen) im vergleich zum frischpräparat unterm DG, fehlten.
nur ca. 5-10% der keime blieben haften. es könnte mit der keim-hülle und deren chemie bzw. löslichkeit
zusammenhängen. eine vorangegangene hitzefixierung ist leider wegen extremer blasenbildung der
fette nicht möglich. wenn die von dir genannten autoren einen trick dabei haben, wär´s schon interessant
zu wissen wie....

ciao,
güntherdorn
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« Letzte Änderung: Mai 22, 2020, 09:27:32 Vormittag von güntherdorn »
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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #4 am: Mai 22, 2020, 09:52:19 Vormittag »
Hallo Günther, der Simon hat es ja bestätigt, was ich durch die Blume auch getan habe. Sicher nicht ganz trivial, was du dir vorstellst: Ausstrich machen und entfetten färben und anschauen; dazu kommt dann noch : was seh ich denn?

 @ Simon der Artikel würd mich auch ineressieren, aber 27.- ist dann zur Befriedigung der Neugier doch etwas zu viel. Du bist wohl in einem Institut, das einen Account hat.
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


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SimonsToaster

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #5 am: Mai 22, 2020, 14:38:19 Nachmittag »
Ich hab nochmal die Publikation durchgelsen. Zuerst, es geht bei ihnen hauptsächlich um Zellen, nicht Bakterien. Dann liest man leider bei der Methodenbeschreibung "Without going into the details of the steps which led up to the devising of this method, it may be described as follows:" Sie erwähnen nur ein "rapid drying", der Hauptteil widmet sich dem Vergleich der "neuen" Methode mit anderen der Zeit.

Ich hab darüber mal recherchiert, weil die Methode in einem meiner Uniscripten allgemein zur Auszählung von Mikroorganismen in dicken Suspensionen geführt wird.

So. Weil ich eh nichts besseres zu tun habe, nächste Uni-Prüfung eh erst in drei Wochen, hab ich mich mal auf die Suche gemacht. Und tatsächlich findet man ein paar Erwähnungen der Methode zur allgemeinen Keimzahlbestimmung, wenn auch gesagt wird das sie gewisse Variabilität aufweist. Auf der Suche einer genauen Beschreibung habe ich dann das hier gefunden: https://www.springer.com/gp/book/9783709195505#otherversion=9783709197974

Ich habs dann über meine Quellen besorgt.
« Letzte Änderung: Mai 22, 2020, 14:43:03 Nachmittag von SimonsToaster »

güntherdorn

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten + aktualisierung
« Antwort #6 am: Mai 24, 2020, 09:27:30 Vormittag »
hallo simon,

danke für die infos per email !
dabei wird auch viel mit zenrifugieren gearbeitet.
somit WAR chem. entfetten für mich passe´.  (alk ist chemisch...siehe unten)

immer wieder toll, dass es aktive "informanten" in unserem forum gibt !

güntherdorn   ..................................................................................................

aktualisierung / erweiterung von heute 14:30:

eigentlich ganz einfach:
milch in eine 2mL-phiole 1x mit 4000U/min. 10min. zentrifugieren und 75% abpipetieren.
anschliessend 2-3x hintereinander mit isoprophyl-alkohol aufgefüllt bei 4000U/min. 5min.
zentrifugieren = "waschen" = entfetten, und immer wieder die oberen ca. 80% abpipetieren.
zum schluss bleibt ein weisser rest von ca. 2-3 kubik-mm im gefäss.
von diesem nur eine winzige menge mit 1 tropfen iso auf dem OT verteilen, damit die keim-
konzentration nicht zu hoch ist. lufttrocknen.
ich hab nun erstmal die gesamtfärbung gentianaviolett  (konz.) 15min. verwendet.
alle verschiedenen keime schön kräftig blau und kontrastreich.
das ganze basierte auf der mail-info von simon.

ciao,
güntherdorn
« Letzte Änderung: Mai 27, 2020, 00:06:09 Vormittag von güntherdorn »
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wilfried48

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten + aktualisierung
« Antwort #7 am: Mai 24, 2020, 17:36:54 Nachmittag »
....
alle verschiedenen keime schön dunkelblau und kontrastreich.
...

Hallo Günther,

du hast vermutlich das falsche Bild eingestellt.

oder wolltest du uns zeigen wie Zentrifugiergefässe aussehen.

viele Grüsse
Wilfried
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Alf

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #8 am: Mai 26, 2020, 18:37:57 Nachmittag »
Lieber Günther,

ich würde den Milchausstrich trocknen lassen, hitzefixieren und den Objektträger danach in Diethylether einstellen. Eventuell einmal wechseln. Dabei sollten sich kaum Keime mehr lösen, sondern nur das Fett.
Eventuell kann man die Milch auch vorher entfetten, indem man sie mit Diethylether ausschüttelt und die Etherphase abtrennt?
Statt Diethylether müsste auch Petrolether (oder einfach Waschbenzin) funktionieren.

LG,
Alf

güntherdorn

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #9 am: Mai 27, 2020, 00:03:43 Vormittag »
hallo wilfried: ich wollte wirklich nur MEINEN phiolen-typ zeigen.

hallo alf: beim hitzefixieren entstehen mächtige blasen und ein fester fettbelag, der ´nimmer wechgeht´.
        ich mein nun nicht "braun-backen".
   ist waschbenzin nicht etwas zu hart? ... andererseits ist alk auch nicht ohne.

danke für eure antworten.

aktualisierung vom 28.5.2020:
hallo alf, ich schrieb doch "ich mein nun nicht, braun-backen".... doch schon nach sekunden,
abhängig von der 1/2-sek-zeit bilden sich (nur wenn fett vorhanden!) über dem spiritusbrenner mehr oder weniger leere
blasen, die kleine kreisrunge leere stellen am präp. sind. schon nach 2 sek..

und zum entfetten der "fettigen OT´s" hatte ich doch geschrieben, dass bei mir im vergleich zur "lebend"-präp.,
nur wenige keime übrigbleiben.  :(

ciao,
güntherdorn
« Letzte Änderung: Juni 06, 2020, 11:52:55 Vormittag von güntherdorn »
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Alf

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Re: milch-präparat vor bakterien-färbung entfetten
« Antwort #10 am: Mai 27, 2020, 12:16:14 Nachmittag »
Hallo Günther,

wie genau gehst du vor? Wie bilden sich dabei Blasen? lässt du die Milch nicht Lufttrocknen und fixierst dann? Beim Hitzefixieren macht man nicht richtig heiß, sondern führt den OT nur kurz durch die rauschende Brennerflamme.

LG,
Alf