Zeiss Axiovert 200

[Eva-Louise]

Hallo zusammen,

arbeitet jemand mit einem Axiovert (IM) 200 im Fluoreszenzbereich? Könnte ein wenig Austausch über Anwendungen der richtigen Objektive für die verwendeten Präparate bzw. allgemeine Einstellungen gebrauchen.
Ich arbeite zurzeit mit Drosophila-Gewebe, durch Reporterproteine (GFP) leuchten bestimmte Gewebestrukturen.
Bin mir nicht sicher, ob ich ,,das Beste" aus den Präparaten ,,raushole" mit meinen Einstellungen/Anwendungen.

Wäre dankbar für Meinungsaustausch... 

VG, Eva

[Rawfoto]

Guten Morgen Eva

Wenn Du ein paar Fotos einstellst wirst Du sicher mehr Tipps bekommen.

Dann könnten dir auch Leute helfen die mit anderen Mikroskopen arbeiten, ein großer Teil ist nicht Mikroskopabhängig.

Mich wundert z.B. Warum du mit einem Inversmikroskop arbeitest, bei dieser Anwendung hätte ich bei Olympus die bessere Auflösung am klassischen Durchlichtmikroskop. Ob das Durchlichtmikroskop ausreicht ist natürlich von der Auflösungsanforderung abhängig, die Technik wird ja z.B. auch am SED angewendet um über die Auflösungsgrenze zu gehen ...

Was wir noch wissen müssten, was für einen UV Cube du im Einsatz hast. Die ,,richtige" Auswahl hat gigantische Auswirkung auf die Qualität des Bildes.

GFP fluoresziert ja im Grünbereich, daher das ,,G"

Ich könnte mit meiner Olympus UV-Einrichtung neun unterschiedliche Cubes einsetzen um zu einem Ergebnis zu kommen, 2 x U, 2 x V, 2 x BV und 3 x B

Dann würden da drei unterschiedliche Lampenhäuser zur Verfügung stehen, HBO, Xenonlicht oder LED - ich bevorzuge HBO ...

Dann gibt es da noch die Vorgehensweise bei der Präparation, das Ergebnis kann sich auch mit der vergangenen Zeit nach der Impfung mit GFP verändern, sprich schwächer werden.

Ohne Ergebnis zu zeigen ist es fast unmöglich zu helfen.

Liebe Grüße aus Wien

Gerhard

[othum]

Hallo Eva,

willkommen im Forum!

Ich arbeite u. a. mit einem Axiovert S100 und auch mit Auflicht-FL. Ich untersuche zwar kein GFP sondern meist botanische Schnitte auf Primär- und Sekundärfluoreszenz, könnte aber vielleicht - wie einige andere hier im Forum - trotzdem helfen.
Und im Ggs. zu Gerhard sehe ich keine prinzipiellen Auflösungseinschränkungen durch den inversen Bau des Mikroskops.

Beste Grüße, Oliver

[Silber_und_Licht]

Guten Morgen!

Ich habe hier insgesamt sieben höchstwertige Fluoreszenzmikroskope von ZEISS, LEICA, NIKON und Olympus. An diesen Geräten werden nahezu alle aktuell interessanten Verfahren (TIRF/FRAP/FLIM usw. ) mit für Langzeitstudien sehr langsam oder auch schnell (Resonanz-Scanner) oder sehr schnell (Nipkow-Scheibe) arbeitenden Mikroskopen durchgeführt. Unter anderem in Verbindung mit Hochauflösungstechniken wie LEICA Lightning, ZEISS Airyscan, NIKON STORM. Optisch ausgestattet mit allem was das Herz des Mikroskopikers welcher gerne "in den Ecken herumpopelt", begehrt. 100x/1,46 ÖL korr. oder 63x/1,46Öl korr. oder 40x/1,40 Öl und auch sonst alles was gut und teuer ist. Sechs von diesen sieben Großgeräten sind Inversmikroskope und das eine aufrechte, speziell mit Multiphotonen-Laser ausgerüstet, steht seit ein paar Monaten mangels passender Aufgaben und Anwendung still. Nach meiner Erfahrung kann ich sagen, dass man in der Biologie/Medizin eigentlich alles was man mit einem aufrechten Mikroskop machen möchte, entsprechend auch an einem inversen Mikroskop durchführen kann ... und noch ein bisschen mehr, wenn gefordert. Ich sehe keinen Grund, für irgendwelche Arbeiten ein aufrechtes Mikroskop zu bevorzugen.

Was das Axiovert 200 anbetrifft, so lässt sich dies sowohl mit den passenden Mikroskop-Optiken als auch mit den passenden Fluoreszenz-Teilern nachrüsten. An und für sich sollten noch alle aktuell im Programm befindlichen Teile passen, wenn man vielleicht auch kleine Umbauten vornehmen muss (Teilerspiegel und Filter auswechseln um den idealen Emissionsbereich besser zu erfassen) und ganz aktuelle Objektive wie das traumhafte 63x/1,46 Öl korr. wegen ihres M27 Gewindes womöglich nur über Zwischenringe anbringen kann. Aber im Grunde ist GFP ja nun nicht unbedingt etwas ganz neues und der passende Teiler ist vielleicht bereits eingebaut. Vielleicht mal auf den vorhandenen Teilerwürfeln nach der Bezeichnungsnummer suchen und diese mit den aktuell auf der Liste der Teilerkombinationen auf der ZEISS Seite (www.micro-shopx.zeiss.com/?s=166953433e4ac4c&l=de&p=de&f=f&a=v&b=d&id=object-0000-128&o=) vergleichen. Hier finden sich für ("e"nhanced) eGFP immerhin 46 Filtersätze. Du musst Dir eigentlich nur noch überlegen, welchen Wellenlängenbereich Du für Deine Auswertung benötigst.

Ergänzung: um die Verteilung der Wellenlängen zu sehen empfiehlt sich mal ein Blick auf folgende Graphik: www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html#

Man kann nicht nur sehen dass die Linienverteilung der Quecksilber-Bogenlampe nicht absolut ideal ist, obschon sie natürlich funktioniert. Eine Xenon-Bogenlampe mit ihrem Kontinuum wäre theoretisch wohl effektiver. Man kann sich den Spectra Viewer für alle denkbaren Kombinationen von Lichtquelle, Farbstoff und Teilerspiegel/Filter konfigurieren und sich in der graphischen Darstellung die Zusammenstellungen auf den Schirm holen.

Vielleicht noch etwas wichtiges, aber vielleicht erzähle ich da auch alten und zur Genüge bekannten Kram: das GFP-Signal ist leuchtend grasgrün. Das häufig und abhängig von der Auslegung des Filterwürfels zu sehende etwas schmutzig wirkende, eher gelbgrüne Signal ist in aller Regel Primär-/Autofluoreszenz/Hintergrund, welche mit dem gesuchten Signal nichts zu tun hat.

Auch wichtig: vergiss Deine Kontrollen nicht!

Freundliche Grüße

Wolfgang

[JB]

Hallo Eva,

Ich kann Ihnen aus mehrfacher eigener Erfahrung nur dringend raten sich an der Uni vor Ort Hilfe zu holen (bei GMOs gehe ich mal von Fachhochschule oder Uni aus).

Entweder bei einer befreundeten Drosophila-Gruppe oder in einem Mikroskopiezentrum. Dort kann man Ihnen genau die Antworten und Erfahrungen aus erster Hand geben die Sie suchen. Praeparation der Embryos oder Fliegen, Auswahl der Mikroskopiemethode (Weitfeld oder konfokal, je nach erforderlicher Aufloesung und Gewebetiefe), Auswahl der Objektive (oder wenn keine Mittel fuer den Kauf von Objektiven da ist, wie Sie das beste aus den vorhandenen machen).

Die Bildgebungsmethoden zu Drosophila sind sehr ausgereift. Fuer jede Anfordung gibt es etablierte Protokolle, von denen man nur wissen muss, der Bildgebungserfolg ist praktisch garantiert. Wirklich nichts ersetzt ein persoenliches Treffen mit einem wissenschaftlichen Mitarbeiter in einer anderen Gruppe, der so etwas schon selbst gemacht hat, oder die Buchung einer Beratung im Mikroskopiezentrum. Nach ein paar Stunden sind Sie weiter als Sie es nach Wochen mit probieren oder Internetsuchen waeren!

Wenn Sie es noch nicht getan haben, geben Sie sich einen Ruck  Besser als Wochen und Monate im Nebel stochern.

Viel Erfolg,

Jon

[Eva-Louise]

Hallo Ihr Alle, lieben Dank für Eure ausführlichen Antworten!
Ich werde versuchen nach und nach darauf einzugehen, ein paar Sachen helfen mir definitiv schon jetzt weiter!
Um meine Erfahrung noch etwas zu konkretisieren, ja, Uni stimmt  . An Drosis arbeite ich bereits länger (Jahre) und hab mit der Präparation und Fixierung der Gewebe von embryonal über larval bis adult viel Erfahrung.
Mein GFP ist als genetisch exprimiertes Protein bereits im Genom der Fliege integriert, ich ,,färbe" also nicht im klassischen Sinn damit, sondern steuere die Expression über das UAS/Gal4-System gezielt in den Zellen/Geweben, wo ich es gerne hätte.
Um noch tiefer einzutauchen, mein GFP ist Teil eines Bio-Sensors (roGFP), mit dem RedOx-Zustände in Zellen/Geweben gemessen werden können.
So, sind wir wieder bei meiner ,,Baustelle", den mikroskopischen Aufnahmen passend zu diesem Sensor. Die Messung erfolgt als Ratio-Messung. Der Sensor (also das roGFP) ändert sein Absorptionsverhalten je nach Oxidationszustand. Ich rege also mit zwei verschiedenen Wellenlängen an (410 nm und 490 nm; nacheinander) und ermittle die Emission nur bei einer Wellenlänge, 520 nm. Mein Anregungslicht kommt von einem Monochromator (LED).
Die Filter haben wir selbst ,,umgebaut" im Filterrad. Genaue Bezeichnungen kann ich leider erst morgen nachliefern.
Hat jemand damit Erfahrung?
Ich wurde gerne mehr über meine Objektive lernen, da ich mich noch sehr unsicher darin fühle einzuschätzen, welches wann am geschicktesten ist. Außerdem über die Filter. Prinzipiell ist mir klar, was die Splitter und die Filter machen, aber ich traue mir noch zu wenig zu ,,daran rumzuwerkeln", obwohl ich das gerne möchte und irgendwann wohl auch können sollte.
@ Jon: das sehe ich genauso, Kommunikation und Austausch ist Gold wert! Allerdings zurzeit garnicht sooo einfach (Corona, entweder sind die Mitarbeiter nicht vor Ort, oder extrem beschäftigt mit der Digitalisierung der Lehre). Von einem Mikroskopierzentrum an unserer Uni habe ich bisher noch nichts gehört, wird aber umgehend gesucht 😉!
@ Wolfgang, auch durch Deine Vorschläge gehe ich in den nächsten Tagen mal noch genauer durch, das passt glaube ich ganz gut
Für heute ist es aber schon spät geworden... ich danke Euch (und freue mich über weitere Nachrichten ☺️)!
Viele Grüße, Eva

[JB]

Hallo Eva,

Vielen Dank fuer die Klarstellung; das ist ja viel kontreter als ich angenommen hatte!

Ich wurde gerne mehr über meine Objektive lernen, da ich mich noch sehr unsicher darin fühle einzuschätzen, welches wann am geschicktesten ist.

Dazu gibt es auf jeden Fall Informationen.

a) Welche Objektive haben Sie?
b) Wie tief im Objekt (Embryo/Larve/Adulte?) ist das Gewebe?
c) Wie hoch muss die Aufloesung sein (x-y und x-z)?
d) Leben die Tiere noch, worin betten Sie das Tier ein (Luft? Pufferloesung? Einbettungsmittel?) und fuer wie lange muss die Messung erfolgen?

Hier ist die Loesung mit Konfokalmikroskopie: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124058835000041?via%3Dihub [vermutlich ist da ein Druckfehler; das Leica-Objektiv ist vermutlich ein PLAPO 40x/1.30, kein 20x/1.30] 

Beste Gruesse,

Jon