Autor Thema: Präparation und Färbung von Großpilzen  (Gelesen 885 mal)

Alf

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Präparation und Färbung von Großpilzen
« am: Dezember 05, 2020, 14:51:44 Nachmittag »
In diesem Artikel möchte ich meine Erfahrungen und Methoden zur Anfertigung von Paraffinschnitten von Großpilzen und deren Färbung teilen.
Als Objekt diente hier ein Wolliger Milchling (wobei ich mir bei der Bestimmung nicht zu 100% sicher bin).


Fixieren-Einbetten-Schneiden:

Es wurden vom Hut des Pilzes kleiner Bruchstücke sofort für 36h in AFE fixiert. Danach wurden die Pilzstücke zurechtgeschnitten und in 70% Ethanol mehrmals gewaschen. Danach wurde entwässert und in Paraffin eingebettet. Dabei wird wie bei der Einbettung histologischer oder botanischer Proben verfahren. Danach wurden die Paraffinblöcke am Rotationmikrotom 3 Mikrometer dünn geschnitten.


Strecken:

Da viele meiner Schnitte von neuen und sauberen Objektträgern abdiffundiert sind und es kaum möglich war Präparate anzufertigen, habe ich 2 Methoden versucht.

a) Auf den Objektträger wurde eine dünne (aber auch nicht zu dünne) Schicht Glycerin-Eiweiß aufgebracht und mit dem Finger ausgestrichen. Danach wurden die Paraffinschnitte aufgelegt.

b) Die Objektträger wurden vorher gereinigt, indem eine Seite in der Bunsenbrennerflamme fast geglüht wurde. Danach wurde der Objektträger noch für ca. 1 Minute in der Luft hin- und herbewegt und danach senkrecht abgestellt. Durch das langsame Abkühlen überleben die meisten Objektträger diese Prozedur. Die Schnitte wurden auf der geglühten und erkalteten Seite aufgelegt.

Danach wurde 1 Tropfen destilliertes Wasser seitlich der Paraffinschnitte aufgetropft, das sich sofort und dem Paraffin verteilte. Danach wurden die Objektträger mit dem Paraffinschnitt nach oben über eine heiße Herdplatte gehalten (keinesfalls direkt berühren), bis die Schnitte schön gestreckt waren. Das Strecken lässt sich dadurch sehr gut kontrollieren und ist meiner Meinung nach besser als das Rausfischen aus dem Wasserbad. Außerdem lassen sich die Schnitte dadurch besser anordnen.


Färbung:

Ich habe verschiedene Färbungen versucht. Leider konnte ich für die bei H. Clemencon so oft erwähnte Säurefuchsin-Eisenchlorid-Tannin-Hämatoxylin Färbung keine Vorschrift finden, weshalb ich etwas experimentieren musste.

I) Tannin-Eisenchlorid-Fuchsin
Nach dem Entparaffinieren und Wässern wurden die Schnitte für 10 Minuten mit einer 10% Tannin-Lösung in Wasser bedeckt. Danach wurde das Tannin kurz mit Wasser abgewaschen und danach mit einer 10 % Eisen(III)chlorid-Lösung weiterabgewaschen. Dabei nahmen die Schnitte eine leicht dunkle Farbe an. Danach wurde wieder gründlich mit Wasser abgewaschen. Als Gegenfärbung wurde für 1 Minute mit einer 1 % Fuchsin Lösung in 75% Ethanol gefärbt. Im Anschluss mit Wasser abgewaschen, danach mit 100% Isopropanol mehrmals abgewaschen, entwässert und am Ende mit Malinol eingedeckt.

II) Tannin-Eisenchlorid-Säurefuchsin-Hämatoxylin
Das Prozedere ist dasselbe wie in I), nur als Gegenfärbung diente eine Hämatoxylin Lösung n. Ehrlich, die mit ein paar Kristallen Säurefuchsin versetzt wurde.

III) Hämatoxylin-Eosin
Gewöhnliche HE Färbung.


Resultate:

Das Verfahren a) führt leider zu starken Farbstoff Niederschlägen, besonders bei der Verwendung von Tannin und schied für mich daher aus. Dünnere Schnitte haften nach verfahren b) problemlos am Objektträger. Dickere Schnitte, über ca. 10 Mikrometer, diffundieren leider ab und man muss sie aufkleben.

Die Färbungen I) und II) führten zu sehr schönen Resultaten und färbten die Hyphen wunderbar an. Die HE-Färbung liefert weniger Kontraste und es wäre eine reine Hämatoxylin-Färbung wahrscheinlich besser.

Die Proben waren sehr groß und die Schnitte auch, weshalb ich nur Ausschnitte zeigen kann.


Fotos:


Abb. 1: Lamelle gefärbt nach I)


Abb. 2: Detailaufnahme mit Färbung I)


Abb. 3: Übersicht mit Färbung II)


Abb. 4: Übersicht mit Färbung II)


Abb. 5: Detailaufnahme mit Färbung II)


Abb. 6: Querschnitt durch den Pilzhut mit Färbung II)


Abb. 7: Detailaufnahme mit Hämatoxylin-Eosin

Peter Reil

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #1 am: Dezember 06, 2020, 09:34:24 Vormittag »
Hallo Alf,

danke für das Mitteilen deiner Erfahrungen!
Mit Paraffin habe ich bei Pilzen auch schon Versuche gemacht, war aber überhaupt nicht zufrieden. Vielleicht sollte ich wieder mal ....?

Freundliche Grüße
Peter
Meine Arbeitsgeräte: Olympus BHS, Olympus CHK, Olympus SZ 30

Bernd Miggel

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #2 am: Dezember 06, 2020, 11:03:20 Vormittag »
Hallo Alf,

auch von mir vielen Dank, sieht beeindruckend aus!
Ich habe gehört, dass es ziemlich kompliziert und langwierig wäre, Paraffinschnitte anzufertigen. Kannst du mir bitte deine Vorgehensweise bei der Einbettung im Datail und die Dauer der einzelnen Schritte mitteilen? Mir würden Schnitte zwischen 10 und 20 µm voll ausreichen.

L.G. - Bernd

Alf

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #3 am: Dezember 06, 2020, 13:35:55 Nachmittag »
Hallo Peter, hallo Bernd,

freut mich wenn ich helfen konnte!


Zitat
Ich habe gehört, dass es ziemlich kompliziert und langwierig wäre, Paraffinschnitte anzufertigen. Kannst du mir bitte deine Vorgehensweise bei der Einbettung im Datail und die Dauer der einzelnen Schritte mitteilen? Mir würden Schnitte zwischen 10 und 20 µm voll ausreichen.

Ich arbeite nach denselben hier präsentierten Methoden:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=36699.msg269208#msg269208

Nur das Strecken der Schnitte habe ich hier anders gemacht. Nach dem Auswaschen des AFE mit 70% Ethanol habe ich die Entwässerung gleich bei 100% Ethanol fortgesetzt. Pilze lassen sich sehr einfach in Paraffin einbetten und vor allem das Schneiden funktioniert reibungslos, sodass ich relativ einfach 3 Mikrometer dünne Schnittserien herstellen konnte. Geschnitten wurde am Rotationsmikrotom. § Mikrometer ist aber schon fast zu dünn, 10 Mikrometer wären optimaler aber ich hatte eben das Problem mit den abschwimmenden Schnitten.

LG, Alf

jcs

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #4 am: Dezember 06, 2020, 17:00:19 Nachmittag »
Hallo Alf,

sehr spannender Beitrag, danke für's Zeigen der gelungenen Bilder und besonders für die detaillierte Beschreibung Deiner Vorgangsweise!

Jürgen

Alf

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #5 am: Dezember 06, 2020, 21:55:31 Nachmittag »
Hallo,

ich habe heute etwas herumexperimentiert und komme jetzt der Säurefuchsin-Tannin-Eisenchlorid-Hämatoxylin Färbung schon sehr nahe.

Die Färbung basiert auf folgendem Verfahren:

Eine es wird eine 10% Tanninlösung in Wasser hergestellt und erhitzt. Danach werden ca. 2ml einer 40% Eisen(III)chorid Lösung zugegeben und man lässt die tiefschwarze Lösung abkühlen. Danach wird mehrmals durch das selbe Filterpapier gefiltert, sodass sämtliche Niederschläger verschwinden. Zu 5 Tropfen dieser Lösung wurden 5 Tropfen Hämatoxylin n. Ehrlich und eine Spatelspitze Säurefuchsin gegeben. Man erhält eine dunkelviolette Lösung.
Nach dem Entparaffinieren und Wässern werden die Schnitte für ca. 10 Minuten mit der Lösung bedeckt. Danach wird die Farbstofflösung abgekippt und der Objektträger in 50 % Ethanol, der ca. 1 % Salzsäure enthält kurz geschwänkt. Im Anschluss wird der Objektträger in Wasser eingestellt, das auf 100 ml maximal 1-2 Tropfen konz. Ammoniak (25%) enthält. Danach wird mit 100 % Isopropanol abgespült, entwässert und in Malinol eingedeckt.

Das Ergebnis ist eine sehr schöne und kräftige Rotfärbung der Zellkerne und Nucleoli, während die Hyphen eine grau-blaue Farbe annehmen. Leider kommt die Güte der Differenzierung auf meinen Fotos nicht so schön zur Geltung wie in Echt. Man könnte das Färbeverfahren dahingehend modifizieren, dass man weniger Hämatoxylin und mehr Säurefuchsin verwendet, wodurch eine noch schönere Differenzierung erreicht werden sollte. Mit dieser Färbung lassen sich die inneren Zellulären Strukturen der Basidien und ihren Vorläufern besonders gut darstellen.

Der schöne Kontrast kommt eigentlich nur auf den Abb. 1 und 2 gut zur Geltung, die Detailaufnahmen erscheinen eher monoton was aber an der Handykamera zu liegen scheint. Ich werde morgen noch einen Versuch machen mit weniger Hämatoxylin.


Abb. 1: Übersicht; die dicke kräftig gefärbte Struktur ist eine Lacitifere, die sich besonders kräftig anfärben


Abb. 2: Ausschnitt aus einer Lamelle mit 2 Lacitiferen


Abb. 3: Detailaufnahme


Abb. 4: Detailaufnahme mit besonders schöner Darstellung zweier Zellkerne und Nucleoli einer Basidiole in der Bildmitte
« Letzte Änderung: Dezember 06, 2020, 21:57:17 Nachmittag von Alf »

Holger Adelmann

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #6 am: Dezember 06, 2020, 22:17:27 Nachmittag »
Sehr schönes Ergebnis Alf, so gute Differenzierugen von Zell-/ Gewebdetails habe ich selten bei Schnitten durch Pilze gesehen!

Grüße,
Holger

Bernd Miggel

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #7 am: Dezember 06, 2020, 22:27:17 Nachmittag »
Hallo Alf,

hochinteressant! Schade, dass die Präparation so aufwändig ist.

Viele Grüße
Bernd

Bernd Miggel

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #8 am: Dezember 07, 2020, 08:17:48 Vormittag »
Hallo Alf,

hast du schon mal versucht, Schleimschichten von Pilzen mit Hämatoxylin anzufärben?
Clemencon ist in seinem Buch "Methods for Working with Macrofungi" ausführlich darauf eingegangen (Hämatoxylin - Phosphormolybdänsäure). Seine Resultate bei einer Schnittdicke von 6-10 µm sind überzeugend. Leider ist seine Einbettung in Methacrylat für mich nicht durchführbar. Aber vielleicht geht es ja mit der Paraffin-Einbettung. ;)

Herzliche Grüße
Bernd

Alf

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #9 am: Dezember 07, 2020, 16:47:30 Nachmittag »
Hallo Bernd,

Nein habe ich nicht, aber es ist fraglich ob das bei einer Paraffin Einbettung überhaupt möglich ist. Ich werde es wenn ich wieder Zeit habe versuchen!


LG,
Alf

unkenheini

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #10 am: Dezember 07, 2020, 19:37:46 Nachmittag »
Moin ,
Ich habe da mal eine Frage,warum bettet ihr nicht in PEG ein?Ich finde das herauswaschen mit warnen Wasser einfacher als das Herauswaschen von Glycerinseife.Ich bin der Meinung dass ich mein PEG1500 von Omikron habe.
Mit freundlichen Grüßen Jörg
Mit freundlichen Grüßen
Jörg G.

p.s. Mir ist es lieber mit Du angesprochen zu werden als mit Sie.Danke.

Bernd Miggel

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #11 am: Dezember 08, 2020, 22:05:48 Nachmittag »
Hallo Jörg,

du hast recht, warum eigentlich nicht?  ;)
Falls du Erfahrungen mit PEG-Einbettung hast: Wie dünn kann ich bei der Methode mit einem Schlittenmikrotom schneiden, sind 10 oder 15 µm erzielbar?
Und welches PEG sollte man nehmen? Ich habe hier PEG1500 und PEG4000.

Viele Grüße
Bernd
« Letzte Änderung: Dezember 08, 2020, 22:21:02 Nachmittag von Bernd Miggel »

unkenheini

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #12 am: Dezember 09, 2020, 04:01:44 Vormittag »
Moin,
Leider habe ich bis jetzt kein richtiges Mikrotom!Ich habe die PEG1500 Einbettung bis jetzt nur an einem umgebauten Handmikrotom ausprobiert.Zum ersten Auswaschen nehme ich warme PEG- Lösung,damit die Schnitte nicht reißen.Ich habe ein möglichst hohes Becherglas genommen,beim Absinken konnten sich die Schnitte schön strecken.Ein Vorteil ist,das ich ich ohne lange Wärmebehandlung zur Not einbetten kann. Beim Queller sind mir die Proben immer stark geschrumpft,daher habe ichdie PEG Lösung (3:1 mit H2O) bei Zimmertemperatur eindünsten lassen,und es ab kaum Schrumpfungen
Mit freundlichen Grüßen Jörg
Mit freundlichen Grüßen
Jörg G.

p.s. Mir ist es lieber mit Du angesprochen zu werden als mit Sie.Danke.

Bernd Miggel

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Re: Präparation und Färbung von Großpilzen
« Antwort #13 am: Dezember 09, 2020, 09:31:10 Vormittag »
Hallo Jörg,
kannst du mir eine kleine Hilfe an die Hand geben, wie bei dir der Arbeitsablauf Schritt für Schritt aussieht, und zwar vom Einbetten und Umschließen mit PEG, über das Schneiden, Auswaschen, Strecken, Eindünsten lassen usw bis hin zum Dauerpräparat? Deine Kurzbeschreibung ist mir nämlich nicht kanz klar.

Hallo Alf,
eigentlich möchte ich deinen interessanten Beitrag nicht mit dem Thema PEG "belasten". Aber ich habe leider keine Ahnung, wie man elegant auf einen neuen Thread zum Thema PEG übergeht, ohne den Faden zu verlieren. :-[

L.G. - Bernd