Giemsa Niederschlag

[mlippert]

Hallo,

Ich habe ein seltsames Problem bei der Firma Färbung. Wenn ich den kommerziellen Giemsa Farbstoff von Roth verdünne, bekomme ich eine schillernde Haut an der Oberfläche und einen lila Niederschlag in der Küvette, die sich sofort an die Oberfläche des Objektträgers anlegen wenn man ihm aus der Lösung zieht. Das resultiert dann in hässlichen Artefakten.
Ich habe ein bisschen mit dem Hersteller kommuniziert, aber die wissen auch nicht was da passiert. Erst war die Idee, es könnte am zu kurzen Stehenlassen liegen oder an Verschmutzungen der beteiligten Reagenzien und Gefäße. War es aber nicht. Egal ob Plastik oder Glas, egal ob A dest oder Puffer, es fällt immer aus. Nächste Idee war, Charge defekt. Auf Arbeit habe ich aber zufällig eine andere Flasche, exakt das gleiche Problem.
Filtrieren bringt nichts, da dann alles im Filter hängen bleibt und ich mit bläulichem Wasser dastehe.
Ich habe jetzt Mal eine Verdünnungsreihe gemacht, mit interessantem Ergebnis: 1:100 und 1:50 zeigen keinen Niederschlag. Ab den empfohlenen 1:20 des Herstellers bis hin zu knapp 1:1 gibt es denn Niederschlag. Bei ca 1:5 ist er am gröbsten. Wenn weniger Puffer als Stammlösung verwendet wird, gibt es ebenfalls keinen Niederschlag.
Hast jemand eine Idee was da passiert? Der Niederschlag ist vollständig wasserlöslich, aber nur in homöopathischen Dosen.
Leider habe ich keine andere Giemsa Lösung als Vergleich...

[JB]

Hallo,

Instinktiv wuerde ich sagen, der Puffer ist das Problem. Messen Sie doch mal den pH Wert der Pufferloesung (1x und 1/20x; sollte identisch sein).

Beste Gruesse,

Jon

[momotaro]

Hi,

PREPARATION OF GIEMSA WORKING SOLUTION:

,, Do not make up a single batch of Giemsa stain for use or re-use throughout the day or longer. Giemsa stain quickly absorbs water vapour in the air, and, when diluted with de-ionized, distilled or any form or water, it rapidly loses its staining properties, so that slides stain poorly after just a short time. The iridescent scum on the surface of made-up Giemsa stain adheres easily to the blood film, making identification of structures difficult."

https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/274382/MM-SOP-04-eng.pdf?sequence=6&isAllowed=y


LG Helmut

[jochen53]

Hallo,
im alten Romeis (16. Aufl von 1968), Ziffer 1396 ff, wird auf dieses bekannte Problem mehrfach hingewiesen:

"Fällt der Farbstoff kurz nach der Herstellung der Vedünnung aus, so ist die verdünnte Lösung unbrauchbar.... Die Ursache dafür kann in ungeeignetem dest. Wasser, unsauberen Glasgefäßen oder in zu alter, verdorbener Stammlösung zu suchen sein. Verdünnt wird da mit abgekochtem oder gepuffertem dest. Wasser; 10 ml davon + 0,3 ml Stammlösung (Giemsa-Hollborn-Original-Stammlösung von Dr. K. Hollborn u. Söhne, Leipzig; Fa. dürfte uralt sein und evtl. nicht mehr existieren), nur umschwenken, nicht schütteln in einem Becherglas, das ausschließlich dafür verwendet wird.
"Die Stammlösung muß sehr gut verschlossen werden, da sowohl Verdunsten des Methanols wie Wasseraufnahme des Glyzerins eine Ausfällung des Farbstoffs (Anm. es sind mehrere: Methylenazur, Methylenviolett, Methylenblau und Eosin. Nach anderen Quellen Azur II und Eosin) zur Folge hat. Luftdicht verschlossen ist sie unbegrenzt haltbar."
Das Ergebnis der Färbung ist offensichtlich stark pH-abhängig.
Es wird auf eine Schnellfärbemethode verwiesen, bei der eine 1 : 1 Mischung aus der o.a. Stammlösung und reinstem Methanol verwendet wird, also kann man die Stammlösung wohl damit verdünnen.
Aber ich nehme an, ihr habt alle den Romeis.
Bei Bruno P. Kremer wird die Merck Lösung 1.09203 mit Leitungswasser 1 : 9 mit etwa pH 7 verdünnt oder einem Phosphatpuffer.
Was ich allerdings nicht weiß, ob die im Handel befindlichen Lösungen dieselbe Rezeptur haben, vermutlich nicht.

Viele Grüße, Jochen.

[mlippert]

Danke für die Tipps! Also an dem Gefäßen liegt es nicht. Ich habe alles mögliche probiert. Das fällt immer aus. pH ist ebenfalls ok. 6.80 mit dem Weise Puffer. Wie gesagt, in A bidest passiert das gleiche (pH 6.4 nach Verdünnung). Die Schnellfärbung ist eine Möglichkeit, richtig. Ich wollte aber schauen, ob ich es erst vernünftig hin bekomme. Im neuen Romeis steht nicht mehr so viel dazu. Nur das mit dem filtrieren. Aber da bleibt dann alles im Filter... Das Problem bei der Färbung ist, dass es dutzende Vorschriften gibt. Davon müssen schon logisch viele falsch sein.
Das Problem mit dem Niederschlag habe ich schon oft an Präparaten im Krankenhaus etc gesehen, ich vermute, Probleme mit der Färbung sind häufig, es kümmert sich nur keiner drum. Ob der Patient eine Leukämie hat sieht man ja auch so.

Grüße,
Micha

[JB]

Der Puffer sollte leicht alkalisch sein. Testen Sie doch mal, ob bei pH 7.2 auch der Farbstoff ausflockt. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC540181/

[jochen53]

Hallo Micha,

hast Du Methanol? Probier doch mal, die Stammlösung vorher mit etwas Methanol zu verdünnen.

Jochen

[mlippert]

Ich habe auch PBS mit 7.2 probiert, das war besser aber immer noch nicht gut, leider. Nützt mir auch nichts, da ich die Farbgebung bei 6.8 brauche, die der Standard ist.
Methanol habe ich da, aber das ist doch eh in der Stammlösung, oder? Wie viel sollte ich den zugeben?

[jochen53]

Hallo Micha,

was in der Stammlösung wirklich drin ist, ist ja nicht veröffentlicht, aber ich würde mal genauso viel Methanol wie Stammlösung ausprobieren und dafür die gleiche Menge Wasser weglassen.

Jochen

[mlippert]

So Methanol ist probiert. Damit erreiche ich zumindest bis 1:20 eine niederschlagsfreie Lösung. Leider löst es aber nicht das Problem der schillernden Haut, die dazu tendiert sich beim rausziehen an die OT zu lagern...

Grüße,
Micha

[mlippert]

Hast eigentlich jemand die Originalarbeiten von Giemsa oder Pappenheim als digitale Version?

[RainerTeubner]

Hallo Micha,

wenn Du die bibliographischen Daten der Originalarbeiten von Giemsa oder Pappenheim hast, kann ich versuchen, sie zu besorgen. Ansonsten kann ich Dir nur subito (https://www.subito-doc.de/) empfehlen: schnell, zuverlässig und preiswert.

Viele Grüße

Rainer

[mlippert]

Also die Versuche mit hoher Konzentration Giemsa und MetOH im Verhältnis 1:1 und auch zusätzlich noch mit Puffer haben beide versagt. Zwar löst sich alles, aber die Kerne werden blau statt lila und das Zytoplasma bleibt farblos, außer in eosinophilen.
In der 1:20 plus 5% MetOH Lösung werde ich den Niederschlag los, aber die Färbung hat ebenfalls das Problem, die Granula nicht anzufärben.
Färbetechnisch das beste Ergebnis gibt die Färbung so wie sie von Thomas Binder et al. Beschrieben ist: May Grünwald 1:1 mit Puffer, Giemsa 1:6 mit Puffer und dann in 3 Stufen Puffer differenzieren und spülen. Aber da ist der Niederschlag halt eine Katastrophe. Ich gebe erstmal auf und warte auf den noch versprochenen Rückruf des Chemikers vom Hersteller und die Lieferung einer anderen Giemsa Lösung von Morphisto.

[jochen53]

Hallo,

ich habe in "Ullmanns Enzyklopädie der Technischen Chemie" im Kapitel "Mikroskopierfarbstoffe" neben dem bereits erwähnten "Romeis" noch ein paar ältere Literaturstellen gefunden:

- H. Adam, G. Czihak: Arbeitsmethoden der makroskopischen und mikroskopischen Anatomie. G. Fischer Verlag, Stuttgart 1964
- H.-Ch. Burck: Histologische Technik. Thieme. Stuttgart 1966
- H. J. Conn: Biological Stains. 9. Aufl., Williams & Wilkins Comp., Baltimore 1977
- H. Harms: Handbuch der Farbstoffe für die Mikroskopie. Staufen Verlag, Kleve 1965

Vielleicht finden sich diese Werke ja noch in der einen oder anderen Institutsbibliothek, falls jemand darauf Zugriff haben sollte. Vielleicht sind da sogar Rezepte drin.

Viele Grüße, Jochen.

[mlippert]

Giemsas Arbeit ist diese hier: Gustav Giemsa: Eine Vereinfachung und Vervollkommnung meiner Methylenblau-Eosin-Färbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nocht'schen Chromatinfärbung. In: Centralblatt für Bakteriologie I Abteilung 32 (1904), S. 307–313.

Keine Ahnung wie man da rankommt, hier hat die Unibibliothek zu wegen Corona...