Experimente mit schiefer Beleuchtung

[Lupus]

Hallo Michael,

... Genauso erkenne ich in einem dreidimensionalen Präparat das Relief durch den Schattenwurf besser. Beim idealen zweidimensionalen Präparat gibt es diesen Reliefeffekt auch bei schiefer Beleuchtung nicht (bei DIK den "Pseudoreliefeffek" schon!).
Für mich entspricht die mikroskopische schiefe Beleuchtung also der schiefen Beleuchtung im täglichen Leben. Deshalb kann ich das Bild, solange ich mich nicht an die optimale Auflösung rantasten will, wie gewohnt interpretieren

dem widerspreche ich, die schiefe Beleuchtung hat nichts mit dem Schattenwurf von 3D-Objekten bei Seitenlicht zu tun. Die Entstehung und auch Interpretation der Strukturen als lokale Phasenänderung und nicht als Dickenänderung entspricht dem DIK-Verfahren.

Hubert

[jcs]

Reine (schwache !) Phasenobjekte zeigen dagegen bei offener Aperturblende keinen Kontrast und sind im Idealfall unsichtbar. Durch Schließen der Aperturblende können aber hier Strukturen sichtbar gemacht werden, weil die Beleuchtung dabei zunehmend kohärent wird und Interferenzen in der Bildebene die Bildhelligkeit dominieren. Umso optisch dicker (Produkt aus Dicke und Brechungsindexdifferenz zur Umgebung) das Objekt ist desto kontrastreicher sind diese Strukturen erkennbar. Daher benötigt man für optisch dickere Phasenobjekte auch kein Phasenkontrastverfahren, im Gegenteil kann es sogar bildverschlechternd sein.

Reale biologische Objekte (z.B. gefärbte Präparate) sind fast immer eine Mischung aus Amplituden- und Phasenobjekt. Da ist dann das moderate Schließen der Aperturblende ein Kompromiss zwischen maximaler Auflösung (Amplitudenobjekt) und Kontrast (Phasenobjekt) sowie Minimierung der Artefakte die durch Interferenzeffekte bei reduziertem Blendendurchmesser entstehen.

Schiefe Beleuchtung dagegen ist primär ein Phasenkontrastverfahren, man muss bzw. soll daher die Aperturblende nicht zur Kontraststeigerung schließen. Stattdessen erfolgt der Phasenkontrast durch die einseitige Ausblendung der Beleuchtungsrichtung, die Unsymmetrie der gebeugten Wellen kann jetzt in der Bildebene durch Interferenz ausgeprägte Helligkeitsunterschiede erzeugen. Und die hohe Auflösung bleibt richtungsabhängig erhalten weil zumindest einseitig die gleichen Beugungsordnungen  in das Objektiv gelangen wie beim Hellfeld.

Hubert

Hallo Hubert,

danke für die klaren Erläuerungen, das macht für mich einiges verständlicher.

Vielleicht als kleine Ergänzung noch ein Bild bezüglich Kontraststeigerung. Eine kohärentere Beleuchtung bei zugezogener Blende führt auch bei Amplitudenobjekten (als Beispiel eine Doppelblende in (a) als Amplitudenobjekt in der Objektebene) zu einer Verstärkung der Kontraste an den Kanten, wie man aus dem Bild erkennen kann. Durch Weglassen der höheren Beugungsordnungen (c) kann es zu einer Verstärkung der Kanten kommen, wie man in (d) sieht. In dem gezeigten Beispiel ist das natürlich schon hart an einem Beugungsartefakt, da die eigentliche Struktur in der Bildebene deutlich verfremdet ist.

Die Köhlerbeleuchtung kann man sich als Summe einer großen Zahl an Teilstrahlen vorstellen, die untereinander inkohärent sind, der Einzelstrahl selbst jedoch kohärent. Je weniger Teilstrahlen an der Bildgebung beteiligt sind, desto mehr dominiert der kohärente Einzelstrahl, mit den damit verbundenen Konsequenzen (geringere Auflösung, Beugungsartefakte, höherer Kontrast).

LG

Jürgen

P.S.: Beste Grüße auch an die vielen anderen Jürgens hier im Thread!

[Lupus]

Hallo Jürgen (H.),

Blende ich hingegen nicht mehr achssymetrisch, sondern etwa mit der Kreuzblende ab, nutze ich auf einer Seite die volle Apertur des Objektives, was vorher nicht der Fall war.

wenn Du eine deutlich unter die NA des Objektives abgeblendete Aperturblende mit einer der NA des Objektives entsprechenden, aber halbseitig abgedeckten Blende vergleichst, dann reden wir natürlich nicht über das Gleiche.

Hubert

[piu58]

Das ist für uns vielleicht schwer verständlich, aber für die mikroskopische Abbildung gilt (wie generell in der Wellenoptik) das Huygens'sche Prinzip: Jeder Punkt ist Ausgang einer Elementarwelle, also einer Kugelwelle. Diese Wellen überlagern sich zum Bild. Prominentes Beispiel: Beugung am Spalt.
Wenn man aus einer an sich recht homogenene Beleuchtung einen kleinen Ausschnitt nimmt, dann kann man dies als homogen ansehen - also alle Elementarwellen "in Phase" und aus den Laufzeitunterschieden und Absorptionsunterschieden das Bild berechnen. Dieses Bild ist also immer ein Beugungsbild.
Bei voller Apertur kann man nicht mehr von einer Phasenkohärenz der Einzelwellen ausgehen, jedenfalls nicht, wenn man mit einer Lampe , LED oder einer anderen technischen Einrichtung beleuchtet. Wenn man einen Stern nähme, dann vielleicht. Nicht-köhärente Wellen verschmieren die Beugungsmuster und es bleibt die Wirkung der Absorption.
Die schiefe Beleuchtung hat nun auch ein verschmiertes Beugungsmuster, aber ein asymmetrisches. Das erzeugt dieses Bild, und nicht etwa der Schattenwurf wie bei einer Landschaft.

[Michael]

Hallo Uwe,

Du hast natürlich Recht - das mikroskopische Bild entsteht durch Wellenoptik. Das gilt aber auch für das "makroskopische" Bild einer Landschaft. Geometrische Optik und Wellenoptik sind kein Gegensatz. Wenn die Abmessungen der beobachteten Objekte in die Größenordnung der Lichtwellenlänge sind, ist die geometrische Näherung nicht mehr gültig. Die Frage ist für mich lediglich, wann der Unterschied bei der Beobachtung auffällig wird und ich die schiefe Beleuchtung nicht mehr wie aus der makroskopische Welt gewohnt interpretieren kann.
Wenn ich ein Haar unter das Mikroskop lege und schief beleuchte, erhalte ich einen Schattenwurf, weil die Abmessungen des Haares weit von der Wellenlänge des Lichtes entfernt sind. Ich habe keinerlei Problem, das mikroskopische Bild zu interpretieren. Betrachte ich die Schattenkante genauer, wird es bei der entsprechenden Vergrößerung Abweichungen zu dem gewohnten makroskopischen Bild geben - die Kante wird unscharf, es wird doppelte Konturen geben etc. Ich beobachte dann auf einer Skala, in der Beugungserscheinungen sichtbar werden. Wie leicht ich das Bild interpretieren kann - ob geometrische Optik genügt oder ich das große Geschütz der Wellenoptik auffahren muss - ist eine Frage der Skala bzw. Auflösung des Bildes.
Ich wage zu behaupten, dass in unserer täglichen "Arbeit" mit dem Mikroskop Beugungs- und Interferenzerscheinungen keine Rolle spielen, da die Abmessungen der betrachteten Objekte meist sehr weit von der Wellenlänge des Lichtes weg sind. Meist werden auch die Probleme mit der chromatischen Aberation der Kondensoren eventuelle Beugungerscheinungen überdecken. Man muss schon einen gehörigen Aufwand treiben, bis man bei der Beobachtung von irgendwelchen Tümpeltieren Probleme mit der Beugungsbegrenzung bekommt.
Deshalb bin ich der Meinung, dass schiefe Beleuchtung für unsere "normalen" Beobachtungen - weit weg von der Auflösungsgrenze unserer Instrumente - gut mit der geometrischen Optik beschrieben werden kann und unseren täglichen Seherfahrungen entspricht.

Viele Grüße

Michael

[Lupus]

Hallo Michael,

ich hatte Dir schon geantwortet, dass die schiefe Beleuchtung - gemeint ist natürlich das Verfahren als Ganzes - nichts, aber auch gar nicht mit dem Reliefeffekt bei der Beleuchtung von 3D Objekten zu tun hat. Das wurde bereits 1866 von Toepler, der durch die Schlierenfotografie zur Sichtbarmachung geringer Brechungsindizes bekannt wurde, nachgewiesen. Er zeigte dass der Reliefeffekt auch bei senkrechtem Lichteinfall entsteht wenn man die Beugungsordnungen ausblendet (Abbe hat nicht alles erfunden was man ihm zuschreibt, aber er war konzentriert auf das Problem der Auflösungssteigerung von Mikroskopobjektiven)

Hubert

[Jürgen Boschert]

Hallo zusammen,

es kommt bei korrekt eingestellter schiefer Beleuchtung definitiv zu einer Steigerung des Auflösungsvermögens des Gesamtsystems (Objektiv + Kondensor) über die von den nominalen Aperturwerten zu erwartende hinaus. Das habe ich gerade noch einmal mit einem Diatomeen-Präparat einer Pleurosigma angulatum überprüfen können. Verwendet habe ich ein Zeiss (West) Neofluar 25 mit achromatisch-aplanatischem Kondensor (nicht immergiert) in Hellfeldstellung an einem Standard Universal. Selbstverständlich korrekt eingestellte Köhler-Beleuchtung. In "normaler", optimaler HF-Beleuchtung mit Ausleuchten der hinteren Brennebene des Objektives zu ca. 3/4 (höhere Öffnung der Aperturblende führt zu Unkenntlichkeit durch zu geringen Kontrast) kann die Feinstruktur auch nicht andeutungsweise aufgelöst werden. Dann habe ich die Aperturblende des Kondensors auf ca. 1/4 der hinteren Objektivbrennebene geschlossen und  soweit aus der Mittenposition herausgedreht, dass gerade keine seitliche Abschattung auftritt (das ist exakt so, wie es in den Zeiss-Broschüren beschrieben ist). Jetzt werden die Alveolen deutlich aufgelöst, sind sogar deutlicher zu sehen als mit dem 40er Neofluar bei optimal eingestelltem HF. Kann jeder selbst testen.

[Lupus]

Hallo Jürgen,

daran zweifle ich überhaupt nicht, aber das ist jetzt etwas ein Vergleich Äpfel mit Birnen weil die Aperturblende bei normaler Hellfeldbeleuchtung und damit die mögliche Auflösung reduziert war. Man kann nicht Phasenobjekte, für die ein Phasenkontrastverfahren eine deutliche Kontraststeigerung bringt mit Hellfeldbeobachtung direkt vergleichen. Es ging doch um die Diskussion, inwieweit höhere Beugungsordnungen bei schiefer Beleuchtung im Vergleich zu symmetrischer Beleuchtung wirken und insbesondere um das Missverständnis dass dadurch die Auflösung (wegen des angeblich doppelten Winkels zum Objektivrand) verdoppelt sei.

Hubert

[jcs]

Ich denke, dass es bei Diskussionen über Auflösungsvermögen wichtig ist, die genaue Versuchsanordnung darzulegen. In diesem Fall heißt das, die Beleuchtung (kohärent, inkohärent) und das Objekt (Geometrie, Phasen- oder Amplitudenobjekt) anzugeben.

Betrachtet man die Bilder zweier punktförmiger, inkohärent leuchtender Objekte in der Bildebene, ergibt sich für das Auflösungsvermögen das bekannte Rayleigh-Kriterium (d=0,61*lambda/NA), siehe untenstehendes Bild (a). Für eine kohärente, zentrale Beleuchtung (zugezogene Aperturblende) zweier punktförmiger Amplitudenobjekte, die sich im selben Abstand wie in (a) befinden, ergibt sich (b). Die beiden Punkte sind nicht mehr unterscheidbar. D.h. die Auflösung verschlechtert sich in diesem Fall. In der Literatur wird oft angegeben, dass bei kohärenter Beleuchtung das Auflösungsvermögen halbiert wird (d=1,22*lambda/NA). Das ergibt dann Bild (d). Man sieht, dass die Verdoppelung des Abstandes ein ganz anderes Bild ergibt, der Faktor 1,22 ist also nicht korrekt in diesem Fall. Besser geeignet ist der Faktor 0,82 (siehe (c)), da ergibt sich dann ein ähnliches Bild wie in (a). Offenbar verschlechtert die kohärente Beleuchtung in diesem konkreten Fall die Auflösung um ca. 30% im Vergleich zur inkohärenten Beleuchtung. In manchen Literaturstellen wird man 0,82 auch finden, aber leider eher selten.

Für Phasenobjekte ist die Situation komplizierter, hier kann eine kohärente Beleuchtung eine Verschlechterung oder auch eine Verbesserung der Auflösung bringen, das hängt von den jeweiligen Phasendifferenzen der interferierenden Wellen in der Bildebene ab. Sprich: Für praktische Zwecke muss man das dann einfach ausprobieren.

LG

Jürgen

[piu58]

Liebe Mikroskopiker, ich habe einmal versucht, auf anschauliche Weise zunächst den Auflösungsgewinn zu erklären

Für die Ausleuchtung betrachte ich (wie auch Ernst Abbe) ein optisches Gitter. Wenn man solch ein Gitter mit monochromatischen Licht beleuchtet, dann bilden sich zyklische Helligkeits-Maxima und Minima. Diese bilden sich durch Interferenz, also Überlagerung von Wellenzügen verschiedener Amplitude. Ein Maximum ergibt sich, wenn die der Lauflängen-Unterschied d aus zwei benachbarten Gitterschlitzen genau eine Wellenlänge beträgt. Das ist eine rein geometrische Betrachtung, und in der Wikipedia gibt es ein schönes Bild dazu. Es ergibt sich auch eine (weiteres) Maximum, wenn der Lauflängenunterschied zwei Wellenlängen, oder ein anderes ganzzahliges Vielfaches ergibt. Den gerade durchlaufenen Strahl nennt man Maximum 0. Ordnung, das erste Nebenmaximum ist 1. Ordnung usw. Den Winkel der Maxmima kann man berechnen, zB. für das erste Maximum

sin φ₁=1 · λ / g

g ist die Gitterkonstante, also der Abstand zweier Linien.
Der Ersatz für solche Gitter sind unsere Auflösungsmessungen an Diatomeen.

Ernst Abbe hat belegt, dass eine Struktur überhaupt erst sichtbar ist (also "aufgelöst), wenn das Objektiv wenigstens das erste Nebenmaximum erfasst.

In den beiliegenden Bildern habe ich einige Fälle dargestellt:
1) Die numerische Apertur des Objektivs ist zu gering, die Maxima erster Ordnung laufen vorbei, das Gitter wird nicht aufgelöst
2) Die numerische Apertur ist größer, das Gitter wird aufgelöst
3) Die numerische Apertur ist wieder kleiner, wie bei 1). Durch die schiefe Beleuchtung läuft aber zumindest eines der beiden Maxima erster Ordnung durch die Linse. Deshalb wird das Gitter aufgelöst, und das ist tatsächlich eine erhöhte Auflösung gegenüber gerader Beleuchtung. Abbe hat das freilich auch gewusst, als er sagte
Irgend eine bestimmte Farbe zu Grunde gelegt, ergiebt sich der betreffende Minimalwerth für rein centrale Beleuchtung durch Division der Wellenlänge mit dem Sinus des halben Oeffnungswinkels, für den höchsten zulässigen Grad schiefer Beleuchtung aber bei jedem Oeffnungswinkel genau halb so gross – sonst gleiche Umstände vorausgesetzt.
(Hervorhebung durch mich)
4) Hier ist die Gitterkonstante größer und die niedrig-aperturige Optik schafft die Auflösung.

Wie ich den Differential-Phasenkontrast anschaulich erkläre, das muss ich mir noch mal überlegen.

[Lupus]

Hallo Uwe,

Du hast das mit den Bildern anschaulich erklärt. Das Problem dieser Diskussion ist aber immer ähnlich wenn das Abbe-Experiment zur formalen Erklärung der Auflösung durch Beugungsordnungen herangezogen wird: Es geht von der Beleuchtung durch eine ebene Welle aus, oder was praktisch das Gleiche ist, von einem Kondensor mit minimalem Aperturblendendurchmesser.

So mikroskopiert aber niemand. Die reale Auflösung wird durch eine nahezu der jeweiligen NA des Objektives angepasste Aperturblende bestimmt, egal ob mit normalem Hellfeld oder schiefer Beleuchtung gearbeitet wird. Über die Frage, wie weit man bei vielen Objekten für einen optimalen Bildkontrast die Aperturblende in der Praxis reduziert, könnte man eine eigene Diskussion führen.

Hubert

[piu58]

Das ist eben ein nicht korrekte Darstellung. Wenn du (un das ist wellentheoretisch!) das erste Nebenmaximum mit erwischtst, dann ist das Gitter aufgelöst. Und durch den Trick der schifeen Beleuchtung schafft man das ja. Es erhöht also wirklich die Auflösung.

Natürlich darf man nicht zusätzlich die APerturblende schließen, sondern muss den Kondensor seitlich versetzen, so dass das Zentrum des Kondensors unter dem Rand des Objektivs zu liegen kommt.

[jcs]

Hallo Uwe,

was Hubert meint ist meines Erachtens Folgendes: Es ist nicht sehr aussagekräftig, die schiefe Beleuchtung mit einer Köhler-Beleuchtung zu vergleichen, bei der die Aperturblende stark geschlossen ist. Das Abbe-Modell setzt auf der Beleuchtung mit einer ebenen Welle auf, was einer geschlossenen Aperturblende entspricht. Nur in diesem Fall hat man auch die Verdopplung der Auflösung.

Wenn man "gerade" beleuchtet und die Aperturblende voll öffnet (was der Praxis eher entspricht), ist der Auflösungsvorteil der schiefen Beleuchtung gegenüber normalem Hellfeld weg.

Jürgen

[piu58]

Eine ebene Welle ist nicht unbedingt eine geschlossene Aperturblende. Es kann einfach eine Kugelwelle eines unendlich kleinen Objekts sein. Oder näherungsweise ein in das Unendliche projizierte Bild einer sehr kleinen Lichtquelle. Dem kommt die Köhler-Beleuchtung schon sehr nahe.

Außerdem kommt es hier bei der Auflösung nicht auf Kohärenz über das ganze Bildfeld an, sondern nur über zwei, drei Gitterzyklen. Ihr könnt selbst mit CDs und DVDs als Reflexionsgitter üben undeuch diese Maxima ansehen. Sogar bei weißem Licht sieht man das ansatzweise. Ich habe auch optische Transmissionsgitter hier und habe das schon paar Mal ausprobiert. Es ist sehr eindrucksvoll.

[jcs]

Das ist doch gerade das Merkmal der Köhler-Beleuchtung: Sie projiziert jeden Punkt der Lichtquelle als Parallelstrahl auf die gesamte Breite des Objektfeldes. Somit ist jeder Teilstrahl eine kohärente, ebene Welle, die Teilstrahlen untereinander sind inkohärent.

Wenn die Kohärenzlänge nur zwei Gitterabstände groß ist, bekomme ich auch Beugung und Interferenz, allerdings sieht das Ergebnis dann anders aus als im Abbe-Modell.

LG

Jürgen