Hochbrechendes Einbettmittel im Test

[peter-h]

Nochmal eine Frage zu den Polarisatoren.

Leider kann ich mit meinem Oly BH-2 zwar den Polarisator drehen, aber nicht den Analysator. D.h. ich müßte also einen Drehtisch nehmen ? Ist denn der Einfluß so enorm ?
@Anne,
kann ich beim Vanox auch den Analysator drehen?

Schönen Abend
Peter

[d65]

In der Tat bezieht sich dieser Hinweis auf UV-Licht. Kurzwelliger als etwa 400 nm wird durch Speedax 1,74 gesperrt. Wir haben eine Transmissionskurve, welche dann auf der Webseite veröffentlicht wird.

Gruß, Georg Abele

Danke! dann könnte grüne und rote Fluoreszenz ja einen Versuch Wert sein. Zeichnet sich schon ab, wann Bestellstart/Lieferstart sein wird?
Liebe Grüße,
Steffen

[hugojun]

In der Tat bezieht sich dieser Hinweis auf UV-Licht. Kurzwelliger als etwa 400 nm wird durch Speedax 1,74 gesperrt. Wir haben eine Transmissionskurve, welche dann auf der Webseite veröffentlicht wird.

Gruß, Georg Abele

Danke! dann könnte grüne und rote Fluoreszenz ja einen Versuch Wert sein. Zeichnet sich schon ab, wann Bestellstart/Lieferstart sein wird?
Liebe Grüße,
Steffen

Hallo d65 ,
die Frage ist doch die der Wellenlänge der Anregungslichtquelle,
die liegt doch meistens im UV-Bereich oder nicht?

LG
Jürgen

[d65]

Hallo d65 ,
die Frage ist doch die der Wellenlänge der Anregungslichtquelle,
die liegt doch meistens im UV-Bereich oder nicht?

Nur für blaue Fluorochrome. Grüne Farbstoffe (Fluorescin und Derivate) werden meist im blauen Bereich angeregt (z.B. 470 nm), orangene im grünen Bereich, und so weiter.

Liebe Grüße
Steffen

[Peter Reil]

Nochmal eine Frage zu den Polarisatoren.

Leider kann ich mit meinem Oly BH-2 zwar den Polarisator drehen, aber nicht den Analysator. D.h. ich müßte also einen Drehtisch nehmen ? Ist denn der Einfluß so enorm ?

Schönen Abend
Peter

Hallo Peter,

klar kannst du den Analysator drehen - wenn du den ganzen Zwischentubus mitdrehst. 

Wie groß der Einfluss ist, weiß ich nicht. Aber ich bin auch nicht Anne.

Liebe Grüße
Peter

[hugojun]

Hallo Steffen,
ich vermute, es wird dann einmal vor und einmal hinter dem Objektträger gefiltert, um das störende UV zu entfernen,
denn energetisch ist man auf die Entladungslampen angewiesen?

LG
Jürgen

[Rene]

Nochmal eine Frage zu den Polarisatoren.

Leider kann ich mit meinem Oly BH-2 zwar den Polarisator drehen, aber nicht den Analysator. D.h. ich müßte also einen Drehtisch nehmen ? Ist denn der Einfluß so enorm ?

Schönen Abend
Peter

Hallo Peter,

klar kannst du den Analysator drehen - wenn du den ganzen Zwischentubus mitdrehst. 

Wie groß der Enfluss ist, weiß ich nicht. Aber ich bin auch nicht Anne.

Liebe Grüße
Peter

No, just a polarizer is enough: here the visibility of the striae/pores depending upon the polarization direction of the illumination. Polarizer was placed beneath the Heine condenser.
Also the direction of the valve between crossed polars is critical.

Best wishes, René

[piu58]

Liebe Mirkoskopiker, dieses Präparat von Anne ist das erste Diatomeen-Test-Präparat, was unter meinem Mikroskop lag. Ich habe zwar ein paar Diatomeen-Präparate, aber kein anderes mit derartig definierter und feiner Struktur. Ich habe durch die Auflösungsversuche einiges über die Beleuchtung an meinem Instrument  (Novex-B) gelernt.

Zunächst begann alles frustrierend. Ich begann ohne Öl. Gyrosigma balticum war kein Problem.
Ich hatte gelesen, dass man Pleurosigma angulatum mit dem 40er Objektiv auflösen kann. Ich habe nichts gesehen. Schließlich habe ich mein Mikroskop geölt und das 100er reingedreht. Damit war es freilich sofort und leicht sichtbar - ist ja auch die doppelte Apertur. Zeichnung liegt bei.

Dann habe ich mich mit Amphipleura pellucida abgequält. Eigentlich kein Erfolg. Bei sehr schiefer Beleuchtung glaubte ich, den Hauch einer Andeutung einer Querstreifung zu sehen. Das kann aber auch Einbildung gewesen sein.

Ich habe bestimmt drei Stunden experimentiert und hatte gefühlsmäßig meine Beleuchtung in Verdacht. Die Novex-B-Serie hat keine Köhler-Beleuchtung, sondern sog. Nelson-Beleuchtung. Da ich aber aus einem VW-Käfer einen Porsche machen wollte, hatte ich mir eine Leuchtfeldblende zugelegt, eine sog. "Köhler-Feldblende". Meinetwegen mag die Feldblende nach August Köhler sein, eine Köhlersche Beleuchtung wird das dadurch nicht. Das habe ich erst gestern richtig begriffen.
Wenn man das Bild der Feldblende mit dem Kondensor in die Objektebene legt, dann bewirkt hat Verkleinerung des Feldes eine Verringerung der (Beleuchtungs-)Apertur zufolge, zumindest beim 40er und 100er. Die Blende sitzt im Strahlengang also an der falschen Stelle und ist damit fast nutzlos. Ich habe dann begonnen, den Kondensor nach möglichst hellem und gleichmäßig ausgeleuchteten Feld einzustellen: Das ist nicht schwer.

Außerdem habe ich mit schiefer Beleuchtung experimentiert. Ich habe eine Phako-Einrichtung, und mit dem Zernike-Kondensor geht das ganz einfach. Ich habe erstmals konsequent in den Tubus ohne Okular geschaut, um zu sehen, in welchem Maß ich schief beleuchte. Die Zeichnung zeigt den Unterschied zwischen oben 1/3 eingedreht (also 2/3 hell) und 2/3 eingedreht (unten). Der Unterschied ist gewaltig.

Schließlich habe ich das Instrument entölt und statt des 100er ein zweites 40er ohne Phasenring eingeschraubt (CZJ Planachromat). Dann habe ich meine neu gelernten Beleuchtungsprinzipien eingestellt. Und plötzlich war es da: Das aufgelöste Bild der Pleurosigma angulatum. Ganz ganz fein, aber scharf. Das war ein faszinierender Moment. Das Bild war sehr subtil, ich habe es deshalb nicht gezeichnet. Vielleicht versuche ich mich noch mal dran. Danach habe ich mein 40er mit Phasenring eingedreht und siehe: Das Bild war gleichwertig. Ich musst nur lernen, das richtige Maß an schiefer Beleuchtung (1/3 eingedreht) zu benutzen und meine Seh-Erwartung zu schärfen.

Mit diesen Erkenntnissen werde ich mich noch mal an Amphipleura pellucida wagen. Nochmal alles mit Öl einzuklecksen, hatte ich gestern keine Lust mehr.

Insgesamt war es eine lehrreiche und am Ende auch erfüllende Beobachtung.

danke, Anne!

[Bob]

Hallo zusammen,
die Vorstellung des Eindeckmittels hat ja hier zu einem hochinteressanten Thread über die Methoden der Kontrast- und Auflösungsoptimierung im Grenzbereich geführt - sehr interessant!
Einige der Methoden sind ja geläufig, aber andere doch sehr speziell und weit entwickelt. Besonders interessant finde ich dabei die Erklärungen, warum diese Methoden funktionieren. Diese Zusammenstellung wird sicherlich immer wieder nützlich sein, wenn man sich mit dem Thema Sichtbarmachung im Grenzbereich befasst.

Viele Grüße,

Bob

[anne]

Hallo zusammen,

Peter, beim Vanox ist der Analysator um 45° drehbar bzw. besitzt einen Hebel der ihn um 45 ° dreht.

Uwe (Piu), dann hat das Präparat ja wirklich viel gebracht und zur Verbesserung allgemein beigetragen! Ich bin ein Fan Deiner Zeichnungen, danke dafür!

Alle: Ich habe nun 18 Präparate mit der Mischung Gyrosigma balticum, Pleurosigma angulatum und Amphipleura pellucida im neuen Eindeckharz verschickt, einige Empfänger davon haben hier schon eindrucksvoll gezeigt, wie sich der Kontrast verbessert hat, danke dafür! Für mich selbst muss ich erst noch ein Präparat machen.
lg
anne

[Lupus]

Hallo,

noch eine ergänzende Bemerkung zum Thema Auflösung - Kontrast - Brechungsindex und Beleuchtungswellenlänge:

Die beugungstheoretische Auflösung ist bei geöffneter Aperturblende (NA_Kondensor = NA_Objektiv am höchsten, auch wenn immer wieder behauptet wird, man könne diese durch schiefe Beleuchtung erhöhen. Die Auflösung bezieht sich auf Amplitudenobjekte mit maximalem Objektkontrast. Wir diskutieren aber oft - und hier nur - über nahezu reine Phasenobjekte mit keinem natürlichen Objektkontrast weil unser Beobachtungssystem Auge oder Kamera nur auf Intensitäten reagiert. Und um einen sichtbaren Helligkeitsunterschied zu erzeugen bedient man sich bekanntlich diverser Phasenkontrastverfahren. Maximale Ausnutzung der potentiellen Systemauflösung Objektiv - Sensor erreicht man nur bei max. Intensitätskontrast, also optimalem Phasenkontrastverfahren. Leider haben Phasenkontrastverfahren den Nachteil dass sie die theoretische Objektivauflösung durch ihre Eingriffe in den Strahlengang etwas verringern. Beim DIK z.B. wird die Auflösung durch die eingebaute Strahlaufspaltung beeinträchtigt. Und die schiefe Beleuchtung wirkt nur in einer Vorzugsrichtung kontraststeigernd, verfälscht also das Objekt.

Das normale Durchlicht-Hellfeld zeigt bei minimaler Phasenverschiebung durch das Objekt praktisch null Kontrast (außer bei Defokussierung). Der Trick ist dann bekanntlich die Reduzierung der Aperturblende weil die Beleuchtung dabei etwas kohärenter wird und durch Interferenz die Objektphasenstrukturen besser in Intensitätsänderungen umgesetzt werden. Aber mit zunehmenden Artefakten. Bei stärkeren Objektphasenänderungen wandelt aber die normale Hellfeldbeleuchtung ebenfalls Phasenunterschiede in Intensitätsänderungen um. Bei starken Phasenverschiebungen sind Phasenkontrastverfahren sogar nachteilig gegenüber der normalen Hellfeldbeleuchtung, weil die Intensitäten dann schnell Sättigung erreichen und Details verloren gegen.

Daher kann man die optimale Beobachtungstechnik für z.B. filigrane Wasserlebewesen und Zellen mit minimalen Brechungsindexänderungen bzw. Dicken nicht mit der für Diatomeenschalen vergleichen. Wenn man die Aufnahme von Peter H. mit Maßstabsbalken ansieht, erkennt man gut die absoluten Strukturdimensionen dieser Diatomee, der Stegabstand dürfte etwa bei 330 nm liegen, die zugehörige Dicke wohl etwas mehr wenn man sich Peters REM-Bild und die Rückseite der Diatomee ansieht. Wenn das diskutierte Eindeckmittel einen etwa um 0.3 höheren Brechungsindex hat als die Diatomee, dann ergibt sich aus dem Produkt geometrische Dicke mal Brechungsindexunterschied eine beachtliche Phasenverschiebung, bezogen auf die Beobachtungswellenlänge, vielleicht so im Bereich 60-70° bei 550 nm mittlerer Beleuchtungswellenlänge. Das ergibt bereits einen optimalen Kontrast bei normalem Hellfeld und wäre für manche Phasenkontrastverfahren schon fast zu viel.

Der Vorteil einer kürzeren Beleuchtungswellenlänge (z.B. LED mit 365 nm) ist ein doppelter: Einerseits nimmt die beugungstheoretische Auflösung des Objektives im Wellenlängenverhältnis zu. Andererseits vergrößert sich auch die Phasenverschiebung durch die optische Weglänge innerhalb der Objektstruktur relativ zur jetzt kürzeren Wellenlänge, und damit verstärkt sich im gleichen Maß der Bildkontrast. Das gilt speziell auch für die normale Hellfeldbeleuchtung.

Aber: Eine kurze Beleuchtungswellenlänge (blau) ist bei visueller Beobachtung kein Vorteil sondern ein deutlicher Nachteil hinsichtlich der Systemauflösung Mikroskop-Auge. Im zentralen Bereich des schärfsten Sehens, in dem das Auge eine Auflösung bis zu 1' erreicht, befinden sich keine blauen Zapfen. Die maximale Augenauflösung mit der größten Zapfendichte liegt im grünen Wellenlängenbereich.

Hubert

[d65]

ich vermute, es wird dann einmal vor und einmal hinter dem Objektträger gefiltert, um das störende UV zu entfernen,
denn energetisch ist man auf die Entladungslampen angewiesen?

Hallo Jürgen,

früher hat man hauptsächlich mit Entladungslampen gearbeitet (zB. Quecksilberdampflampen), aber die sind dank LEDs auf dem Rückzug. Für manche Anwendungen reicht auch eine Halogenlampe - allerdings dann bei vielfach längeren Belichtungszeiten. Und mit dem Auge sieht man nicht so viel.

UV-Filter braucht man aber auch bei UV-Anregung eigentlich nur einen, nämlich den Sperrfilter im Filterblock. Siehe auch https://de.wikipedia.org/wiki/Fluoreszenzmikroskopie#Aufbau_von_Fluoreszenzmikroskopen

Das war ein faszinierender Moment.

und ist das nicht großartig 

Steffen

[hugojun]

Hallo Steffen ,
vielen Dank. Mir war nicht bewusst, dass die anregende - und fluoreszierende Wellenlängen so dicht
beieinander liegen können. Da ist der Anspruch an die Bandbreite der Filter/LED´s schon ziemlich hoch.
Wie im Beispiel Wikipedia gezeigt: Anregung 490nm, Emission 520nm .
LG
Jürgen

[peter-h]

Hello René

your explanation was just right for me. With the Heine condenser and a polarizer, I could see the difference in the 90 ° positions very well. Once only the strips and then the pores. Although my camera has pixels with 2.2 x 2.2 µm and otherwise behaves well, I have to consider getting a new, sensitive and faster monochrome camera. Thanks for this explanation and the pictures.

Greetings
Peter

[piu58]

Ich habe mich jetzt noch einmal mit Amphipleura abgemüht. Ungefähr 90 Minuten mit Kondensorstellung (wenig EInfluss), Aperturblene und schiefer Beleuchtung experimentiert. Ich konnte die Streifung nur blickweise und schemenhaft sehen. Es war sehr schwierig. Es galang bei ganz schwach zugezogener Aperturblende und 1/3 - 1/5 schiefer Beleuchtung.

Es wird gesagt, dass die 100er Objektive besonders stark vom Phasenring beeinflusst werden, also verschlechtert. Ich muss mir mal ein anderes 100er kaufen, um das herauszubekommen. Jenaer Optiken fliegen bestimmt noch viele rum. Ich hatte selbst mal welche, hab das aber weggeben.