Zum Umgang mit Nanolitern in der Ultramikrochemie

[Reinhard]

Hallo Freunde,

Als die Methoden der Mikrochemie zur Bearbeitung immer kleinerer Stoffmengen zu grobschlächtig wurden, entwickelten Wissenschaftler wie Paul L. Kirk und sein Schüler
Burris B. Cunningham (beide urspr. UC Berkeley/später Manhattan Projekt)) Techniken und Geräte, die sie in die  Lage versetzten, mit nur einem Tausendstel  der in der Mikrochemie
üblichen Mengen umzugehen; das heißt, es mussten damit Mengen im Mikrogramm- und Nanoliterbereich handhabbar werden, und das nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ.

Zur Verdeutlichung: 
Ein Würfel der Kantenlänge 1 mm enthält 1 µl Wasser, das wiegt dann 1 mg!
Das ist der Bereich der Mikrochemie.
Wenn der Würfel  eine Kantenlänge von 100 µm hat, enthält er 1 nl (Nanoliter) und wiegt 1 µg.
Das wäre dann Ultramikrochemie.

Man muss sich also für die Ultramikrochemie Geräte ausdenken, die Quantitäten im Nanogramm- bzw. im Nanoliterbereich messen können.
Meine "Cahn"-Waagen z.B. messen zuverlässig mit einer Empfindlichkeit von 100 Nanogramm;
Waagen, die bereits im Rahmen des "Metallurgical project" (ab 1943) eingesetzt wurden, im ein- und zweistelligen Nanogrammbereich.
( https://www.mikrochemie.net/die-mikrowaagen-des-metallurgical-project/)
Nanolitermengen Flüssigkeit sind theoretisch leicht über eine Hamilton-Spritze mit angeschlossener Mikrometerschraube abmessbar.
Eine 10 µl-Hamilton sollte bei 10 Teilstrichen der Mikrometerschraube etwa 16,7 Nanoliter über eine sehr fein ausgezogene Kapillarpipette abgeben.

Die sich daraus ergebenden Schwierigkeiten wurden in der Diskussion zu meinem letzten Beitrag

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=39245.msg288924#msg288924

von Olaf's Sohn Jan, der als Biochemiker selbst mit solchen Mengen konfrontiert ist, angesprochen.
Es ging darum, daß grundsätzliche Probleme bestehen, Mengen von unter 0,5 µl zu handlen, ohne daß Kapillar- und andere Kräfte dabei eine sehr störende Rolle spielen.

Das hat mich dazu ermuntert, zu zeigen, wie Mengen im einstelligen Nanoliterbereich relativ sicher abgemessen und abgegeben werden können.



Bild1
Ein "Schmelzpunktröhrchen" mit einem Außendurchmesser zwischen 1 mm und 1,6 mm wird zu einer möglichst feinen Kapillare (von ~1 m Länge) ausgezogen.
Auf einer staubfreien Glasplatte werden an der dünnsten Stelle mithilfe eines kleinen Keramikmessers (Hilgenberg) Abschnitte von 10mm bis 20mm abgeschnitten.
Damit man sie überhaupt sieht, liegt eine Lichtquelle tangential zur Glasplatte.



Bild2
Das abgeschnittene Stück wird zunächst leer, dann mit einer Flüssigkeit bekannter Dichte und niedrigen Dampfdruckes gefüllt und auf einer Cahnwaage gewogen.



Bild3
Auf andere Weise wird unter dem Mikroskop der genaue Durchmesser des Kapillarstückes bestimmt, indem es, nach Füllung mit einer farbigen Flüssigkeit und
Abdecken mit Immersionsöl, mithilfe eines Okularmikrometers vermessen wird. So kann der Inhalt relativ genau als Nanoliter-Menge berechnet werden.



Bild4
Nun schiebe ich vorsichtig ein gleichkalibriges Segment zur Hälfte in ein Röhrchen des Durchmessers 1 mm oder weniger und klebe es unter dem Stereomikro mit einem
winzigen Tropfen Klebstoff fest. Die Verbindung muss auch luftdicht sein. Die Länge des Kapillarstückes wurde ebenfalls möglichst genau bestimmt.



Bild5
Hier ein kleiner Vorrat an Pipetten, die ich als Nanoliterpipetten bezeichne. Das Volumen dieser hier beträgt zwischen 20 und 40 nl.
Mittlerweile gelingt es mir, solche mit Volumina im einstelligen nl-Bereich herzustellen.



Bild6
Hier die von mir angewandte Anordnung. Die Nanoliterpipette ist in einem Mikromanipulator befestigt und über einen passenden Schlauch mit
einer "Agla"-Spritze verbunden. Der wesentliche Vorteil der Anordnung: Durch leichten Druck wird genau die Gesamtfüllung des Kapillarabschnittes
abgegeben und auch nur diese. Ein weiteres Heraussaugen von Flüssigkeit durch Kapillarkräfte ist nicht möglich. Noch unter leichtem Druck wird
die "Nadel" zurückgezogen.



Bild7
Ein weiteres Problem beim Umgang mit Nanolitermengen ist die Verdunstung. Dafür wurden schon vor etwa 100 Jahren "Feuchtkammern" entwickelt.
Hier ein Selbstbau, abgedeckt. Im "Ernstfall" werden nasse Filterpapierstückchen an Boden und Seitenwänden angebracht und das "Dach" mit einem
großen Deckplättchen versehen.



Bild8
Vor der Entnahme; diese Nanoliterpipette hat einen inneren Radius von 0,06mm, kann also ein Volumen von 11,3 nl/mm aufnehmen.



Bild9
Die Kapillare füllt sich sebsttätig. Der Vorgang kann durch Zurückziehen gestoppt werden. Hier zur Demonstration eine mit Kongorot gefärbte, verdünnte
Glyzerinlösung.



Bild10
Die zum Teil befüllte Pipette steckt nun im Aufnahmegefäß. Dieses ist mit einem "repellent" behandelt! Man beachte den hinteren Rand der Flüssigkeit
in der Pipette.



Bild11
Abgabe eines kleinen Teils der Flüssigkeit in das Gefäß. Der hintere Rand der Flüssigkeit hat sich verschoben.
Zu meiner Überraschung hat das Kongorot wohl mit dem Repellent reagiert (zu Lumumbablau?)
Nun kann man die dislozierte Flüssigkeitsmenge sowohl durch die Verschiebung in der Pipette als auch im Konus (V=0,33 x pi x r² x h) berechnen.
Sie beträgt hier 18 - 20 nl !



Bild12
Hier eine weitere Standard-Anordnung zum "handlen" von Nanolitermengen. Die Dosiereinrichtung, vor Jahren von Olaf gebaut, enthält eine
Hamilton-Mikroliterspritze in einem POM-Bett und eine genau axiale Mikrometerschraube. Ich habe nachträglich noch Neodym-Magnete am Ende des
Stempels und eine kleine Zwinge angebracht, um auch kleinste Bewegungen der Spritze abzustellen.



Bild13
Ganz wichtig: das gesamte System bis zur Öffnung der Kapillarpipette muss vollkommen gasfrei sein! Dann lässt sich auch durch minimale Drehung
der Mikrometerschraube ein Tröpfchen wie das abgebildete stabil darstellen; hier mit 4-5 nl !



Bild 14
Eine abgesetzte Flüssigkeitsmenge von etwa 15 nl in einem "silanierten" ("rainX") Gefäß. Kein Hochkriechen, kein Herausziehen weiterer Flüssigkeit usw..
In diesem Bild ist ein Vorratsgefäß mit Wasser gefüllt. Der Meniskus ist deshalb verschwunden, ebenso wie das sehr störende "Hochkriechen" an der Kapillare!
Es können problemlos kleinste Flüssigkeitsmengen hineingebracht oder herausgezogen werden.


Viele Grüße
Reinhard

[hugojun]

Hallo Reinhard,
es stock mir der Atem, wenn ich Deinem Bericht folge, aus Angst ich könnte vor dem Bildschirm Deine Apparaturen erschüttern.
Ein eindrucksvoller Bericht.
Die Metallurgie stelle ich mir als Proben Spender nicht vor. Da schwirren eher so Bilder in meinem Kopf ,wie bei einer Spurensammlung
an einem Tatort oder die Expertise eines Ölgemäldes, wo man ja nicht unbegrenzt Farbschichten entfernen kann, um Probematerial zu bekommen.

LG
Jürgen

[smashIt]

Wenn der Würfel  eine Kantenlänge von 1 µm hat, enthält er 1 nl (Nanoliter) und wiegt 1 µg.

sollten da nicht 100µm stehen?
alternativ fl und pg?
oder hab ich gerade einen knopf im hirn?

[Reinhard]

Hallo Jürgen,

der in meinem Beitrag oben erwähnte Paul L.Kirk (UC Berkeley) war in den 40er und 50er Jahren der führende Experte
für die Forensische Kriminalistik und schrieb mehrere Standardwerke hierzu, z.B.: "Crime Investigation" /1954. Da ist also schon ein Zusammenhang.

Viele Grüße
Reinhard

[Reinhard]

Hallo Chris,

ich muss selbst immer aufpassen, daß ich mich bei den Sprüngen zwischen den Größenordnungen nicht verheddere.
Aber hier weiß ich nicht genau, was Du meinst.

Viele Grüße
Reinhard

[smashIt]

kantenlänge 100mm -> 1l
kantenlänge  10mm -> 1ml
kantenlänge   1mm -> 1µl
kantenlänge   0,1mm=100µm -> 1nl
kantenlänge   0,01mm=10µm -> 1pl
kantenlänge   0,001mm=1µm -> 1fl

[Lupus]

Hallo,

kantenlänge 100mm -> 1l
kantenlänge  10mm -> 1ml
kantenlänge   1mm -> 1µl
kantenlänge   0,1mm=100µm -> 1nl
kantenlänge   0,01mm=10µm -> 1pl
kantenlänge   0,001mm=1µm -> 1fl 

das muss man jetzt nicht schrittweise an den Fingern abzählen. Von 100 mm Kantenlänge (1 Liter) zu 0.001 mm ist es der Faktor 10^-5. Das Volumen ist die dritte Potenz davon, also 10^-15 Liter = 1 fl.

Hubert

[Reinhard]

Hallo Chris,

jetzt weiß ich, was Du meinst und Du hast natürlich recht! Ich hab's oben korrigiert.
Danke auch Hubert.

Viele Grüße
Reinhard

[olaf.med]

Lieber Reinhard,

wieder einmal hast Du mich völlig sprachlos gemacht. Ich finde es einfach grandios wie Du fast mit einzelnen Atomen hantierst und ich bewundere das sehr!

Herzliche Grüße,

Olaf

[Florian D.]

Reinhard,

phantastische Arbeit. Bei einer Freigrenze von > 10 Mikrogramm für Pu-239, könntest Du ja sogar die Originalexperimente zu den Transuranen problemlos nachkochen :-)

Viele Grüsse
Florian

[reblaus]

Lieber Reinhard -

einfach Wahnsinn was Du da wieder so treibst - erinnert mich an diese Mikroschnitzereien bei denen man die entscheidenden Handlungen zwischen zwei Herzschlägen macht!

Möge Dir Deine ruhige Hand an covidfreiem Körper noch mindestens 3 Jahrzehnte erhalten bleiben!

Rolf

[Reinhard]

Lieber Olaf,
lieber Florian,
lieber Rolf,

es freut mich sehr, wenn Euch der erneute kleine Ausflug in die Mikrochemie gefallen hat.
Das ist dann auch immer Ansporn, etwas Neues zu probieren.

@Florian: 10 µg Pu-239: da läuft einem alten Radiologen ein wohliger Schauer über den Rücken! 
Bis dahin könnte sich mein Herz an einer noch kleineren Menge (0,29 µg) Am-241 aus einem älteren
Rauchmelder erwärmen. 
@Rolf: ruhige Hand...nun ja. unangenehmer ist die Einäugigkeit bei solchen Unterfangen; bin selbst
erstaunt, was mit Übung trotzdem geht.

Viele Grüße
Reinhard

[treinisch]

Hallo Reinhard,

lange nicht mehr meine Begeisterung artikuliert! Das ist einfach richtig richtig genial, was Du da tust! Und super spannend! Gerne immer mehr davon!

Herzliche Grüße

Timm


P.S. Vielen lieben Dank für den Austauscher!

[witweb]

Hallo Reinhard,

was du da machst, ist ja wirklich faszinierend. Ich bin stolz, wenn ich mal 1mg halbwegs reproduzierbar abwiegen kann, aber was du da beschreibst und uns zeigst...
Eine andere Welt!

Herzliche Grüße

Michael

[micromax]

Hallo Reinhard,

auch von meiner Seite ein "Hut ab". Ich interessiere mich schon lange für Mikrochemie. Das was Du machst stellt die Tüpfelanalysen die ich als microchemische Tests immer mal wieder versucht habe ziemlich in den Schatten.

Ich lese immer wieder gerne über Deine neuesten Experimente.

Viele Grüße
Thomas