Paraffinschnitte auf Objektträger

[Dr. Jekyll]

Moin,

meine botanischen Paraffinschnitte halten nicht auf dem Objektträger. Beim Färben lösen sie sich. Wie kann ich das verhindern?

[JoachimHLD]

Hallo Harald,

ich verwende daür Glyzerineiweiß, siehe Kremer Das große Kosmos-Buch der Mikroskopie Seite 256.

Viele Grüße
Joachim

[Dr. Jekyll]

Hallo Joachim,

verträgt sich das mit Euparal?

[Anton Berg]

Hallo Harald,

aus dem Streckbad verbringe ich die Paraffinschnitte auf eine Wärmeplatte, die mit 45 °C betrieben wird. Die Schnitte haften übers Färben hinaus bis zum Eindecken.

[Florian Stellmacher]

Moin Harald,

das Eiweißglyzerin wird ganz dünn mit einem Fingerstrich aufgetragen und stört die weitere Färbung und das Eindecken nicht. Mitunter sieht man einen schwach mit  angefärbten Schleier am Schnittrand, wenn man zu dick aufgetragen hat.

Herzliche Grüße,
Florian

[Dr. Jekyll]

Hallo Anton,

is ja gut und schön, aber bei mir halten die Schnitte eben nicht nach Trocknung bei 45°  .

Hallo Florian, hallo Joachim,

danke für die Info. Dann probier ich es mal mit Eiweißglycerin.

[Bob]

Hallo Harald,
da gibt es mehrere Einflussfaktoren:
- Sauberkeit Objektträger (Ich putze mit Aceton-Isopropanol-Mischung)
- Zustand Glasoberfläche (Änderung durch durch Flamme ziehen möglich, mache ich nicht)
- Beschichtung (Ich habe Einweißglycerin benutzt, aber auch Schnitte ohne zum Halten bekommen)
- Sauberkeit Streckbad (Mit der Zeit bildet sich an der Oberfläche ein Film, mit Papier abfischen)
- Trocknen (Schräg in warmer Luft)
- Aufschmelzen (Wärmeplatte so warm, dass Paraffin anfäng weich zu werden)
- Dauer Prozessschritte

Beschreibe doch mal Deinen Prozess, vielleicht fällt uns etwas auf, wo Variation sinnvoll wäre.

Viele Grüße,

Bob

[Dr. Jekyll]

Hallo Bob,

die Schnitte übertrage ich in ein blasenfreies Streckbad (ca. 40-45°C). Danach fische ich die Schnitte mit einem, mit EtOH gereinigtem Objektträger, aus dem Bad und lasse sie senkrecht bei 45-50°C im Trockenschrank trocknen (über Nacht). Anschließend entferne ich das Paraffin mit TissueClear, übertrage dann in Isoprop. 30min., 100% EtOH 30min., 80% EtOH- 70% EtOH- 50% EtOH- 25% EtOH und färbe  (nach Wacker) in einem Versandgefäß für Objektträger in senkrechter Stellung. Einige Schnitte überstehen den Vorgang. Etliche aber leider nicht.

[Florian Stellmacher]

Moin Harald,

an Deinen Alkoholstufen liegt es jedenfalls nicht. Wenn diese zu grob sind, kommt es zu Verwirbelungen, durch die der Schnitt abgelöst werden kann.

Herzliche Grüße,
Florian

[Dr. Jekyll]

Moin Florian & Joachim,

liege ich richtig mit meiner Vermutung, dass das Eiweißglyzerin  auf dem Objektträger erst trocknen muß?

[Bob]

Hallo Harald,
was mir bei deinem Verfahren auffällt:
- Ich erwärme die getrockneten Objektträger mit Schnitt nochmal, bis das Paraffin anfäng weich zu werden
- Meine Zeiten in den Bädern sind kürzer, 2x3-5 Minuten Xylol, danach Alkoholreihe 6 Stufen je 2 Minuten.

Das Eiweißglycerin trage ich aus einer Pipettenflasche auf, ca. 1/3 Tropfen, und verreibe es hauchdünn mit dem Handballen, dann ein paar Minuten trocknen lassen.

Das funktioniert auch nicht immer, aber doch überwiegend.

Viele Grüße,

Bob

[Gert Flemming]

Hallo,

natürlich muss das Eiweissglycerin vor der Weiterbehandlung des aufgebrachten Schnittes erst trocknen und dann nochmal bis etwa zum Schmelzpunkt des Paraffins erwärmt werden, zu seiner Koagulation.
In den Alkoholstufen reicht eine Verweildauer von mindestens zwei, maximal fünf Minuten voll aus. Bei den genannten Verweilzeiten fast im Stundenbereich (und dann auch noch bei nichtkoaguliertem Eiweiß) muss der Schnitt ja abschwimmen.
Wie oben von mir genannt, behandele ich meine Schnitte seit Jahrzehnten und das klappt (fast) immer sehr gut.
MfG
Gert Flemming

[Florian Stellmacher]

Moin Harald,

da hat Gert schon Recht. Ich hatte Deine Verweilzeiten gar nicht richtig registriert und mich auf die Konzentrationsschritte konzentriert. Du kannst diese wirklich sehr viel kürzer machen. Überleg mal, wie viel Materialvolumen hier entwässert wird!
Allerdings habe ich noch nicht beobachtet,  dass mir Schnitte abgeschwommen wären, wenn ich sie mal sehr lange im Alkohol stehen gelassen hätte.

Eiweißglyzerin kannst Du im Ofen trocken und dabei gleichzeitig erwärmen, das geht dann in einem Schritt. Ich nehme dafür 20er Pappmappen.

Kannst Du noch einmal gucken, wann genau die Schnitte sich ablösen und ob es bei diesen Schritten ggf. Konzentrationsunterschiede gibt, die zu groß  sind? Das kenne ich durchaus auch, wenn Farbstofflösungen höhere C2-Konzentrationen haben. Testweise kannst Du das ausprobieren, in dem Du den entwässerten Schnitt mit dem Farbstoff überschichtest und guckst, ob sich die Flüssigkeit verwirbelt.

Herzliche Grüße,
Florian

[Dr. Jekyll]

Moin an alle  ,

danke für die hilfreichen Tipps. Ich mache mich jetzt mal ans Ausprobieren. Werde euch dann berichten wie es läuft.

[Gert Flemming]

Hallo Harald und Florian,

natürlich, auch mir hat sich noch nie ein vorschriftsmäßig mit Eiweissglycerin aufgeklebter Schnitt im Alkohol abgelöst. Aber vorschriftsmäßig heisst zum Beispiel, dass das Eiweissglycerin sowohl vor als auch nach dem Herausfischen des Schnittes aus dem Streckbad getrocknet werden muss. Sonst kann man es ja gleich wieder mit Wasser abspülen. Und der aufgeklebte und getrocknete Schnitt mit der Klebeschicht muss zur Koagulation des Eiweißes erwärmt werden.
Wenn ich meine Schnitte (Pilze und andere Pflanzenschnitte) z. B. in Pianese färbe, lasse ich sie bis zu drei Stunden in der Färbelösung - sie lösen sich dabei nicht ab.

MfG
Gert Flemming