Autor Thema: Ölimmersionen mit Wasser immergieren  (Gelesen 5921 mal)

Piper

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Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« am: Januar 06, 2010, 23:16:15 Nachmittag »
Hallo,
bin heute mal dem Hinweis von Herrn Kauer gefolgt (vgl. Artikel im Mikrokosmos Heft 4 2009, S. 229 ff.) und habe eine sehr hochaperturige Ölimmersion (Leitz NPL Floutar 40/1,40 Floureszenz) mit destilliertem Wasser anstelle von Öl immergiert und einen gefärbten Routine-Blutausstrich im Hellfeld untersucht (Leukämie, viele gefärbte Leukozyten mit diversen Granulationen und abnormen Chromatinstrukturen, Dauerpräparat unter Deckglas). Eine Auflösungsverringerung war tatsächlich, wenn überhaupt, nur marginal erkennbar, und der Kontrast schien im Vergleich zu Öl möglicherweise noch leicht angehoben. Fazit: Im Alltagsgeschäft kann man, zumindest bei diesem Objektiv, ohne relevante Qualitätseinbußen getrost auf Wasser zurückgreifen und sich über die unkomplizierte Reinigung freuen.
Ich hatte andererseits den Eindruck, dass der Arbeitsabstand bei Immersion in Wasser spürbar niedriger lag als bei Verwendung von Öl. Daher meine kleine Frage in die Runde: Hat jemand schon eine ähnliche Erfahrung gemacht, bzw. kennt jemand eine Faustregel, in welchem Maß sich der Arbeitsabstand in Abhängingkeit vom Immersionsmedium verändert? Oder ändert sich der Arbeitsabstand tatsächlich nicht, so dass ich einer Täuschung aufsitzen würde?
Vele Mikrogrüße
Jörg Piper


 

Gunther Chmela

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Re: Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« Antwort #1 am: Januar 06, 2010, 23:27:30 Nachmittag »
Lieber Herr Piper,

Ihre konkrete Frage kann ich leider nicht beantworten. Aber in dem Zusammenhang könnten vielleicht meine diesbezüglichen Erfahrungen interessant sein, die ich seinerzeit hier geschildert habe:

http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?1,10589,10589#msg-10589

Beste Grüße!
Gunther Chmela

Eckhard F. H.

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Re: Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« Antwort #2 am: Januar 07, 2010, 07:19:34 Vormittag »
Hallo Jörg,
erbitte Nachsicht für ´Link statt´Antwort. Aber schau mal hin.
Gruß - Eckhard N.
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=3912.0

peter-h

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Re: Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« Antwort #3 am: Januar 07, 2010, 11:20:38 Vormittag »
Hallo Herr Piper,

ich habe mal schnell gerechnet. Für ein angenommenes Objektiv mit f= 2,5 mm und einem Deckglas mit 0,17 mm bei einem Brechwert von 1,515 , ebenso das Öl mit n= 1,515 angenommen, wird sich der Arbeitsabstand bei Austausch von Öl nach Wasser mit n= 1.333, um 20µm verkürzen.

Eine Fausformel habe ich nicht dafür, sondern nur das paraxiale Gebiet für diesen Fall gerechnet.

Schöne Grüße
P. Höbel

Rene

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Re: Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« Antwort #4 am: Januar 07, 2010, 12:41:55 Nachmittag »
Hello all,

As images show more then a thousand words (or so they say), I've made a couple of images showing the difference between the different immersion media.


Dry:

water immersion

glycerol 86% immersion, calculated RI 1.45

Standard oil immersion


Technicalities: objective olympus 60/1.4 planapo, condenser aperture 0.55 (inverted microscope). Direct projection via the tubelens on the chip (Tucsen 3Mp cmos).
Diatom Podosira stelliger, 45 um wide. Images resized 50% and cropped, but otherwise not worked on. The 'hyaline' centre of the valve still shows some internal structure, which is a critical test for objectives. With glycerin immersion, the structure cannot be seen 'in focus', but can be detected when slightly underfocussing.

As this is a watermount, the objective is effectively capped to NA 1.33, even though the objective has an NA of 1.4. Therefore, it can be stated that the differences between water-glycerin-oil can be solely attributed to the increasing spherical abberation when changing immersion media. The dry one is of course capped to an NA of 1.0 (air) so cannot be directly compared in this respect.

I can confirm Peter H's findings. Additionally, when using another oil immersion lens (20/0.8), the lenses stay parfocal with eachother if the same immersion medium is used. 

Best wishes, René

Piper

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Re: Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« Antwort #5 am: Januar 07, 2010, 13:04:28 Nachmittag »
Hallo an alle,

vielen Dank für die schnellen Antworten und die Links. Ich vermute, dass ich die 20 ym Arbeitsabstandsverringerung vielleicht nur intuitiv erfasst habe und bin beruhigt, dass ich also nicht Gefahr laufen werde, durch die Verwendung von Wasser infolge relevanter Arbeitsabstandsverringerung mein Präparat oder die Objektivfront zu beschädigen.

Anbei noch ein kleine Überlegung zu den abweichenden Testergebnissen von Gunther Chmela und Rene, bei dersen Tests ja im Endeffekt herauskam, dass man das Eintauchen von Ölimmersionen in Wasser besser lassen sollte.

Ich hatte das hochaperturige 40-fache Floureszenzobjektiv im Durchlicht/Hellfeld an einem hierfür vorgesehenen Auflicht-Floureszenzmikroskop verwendet, und zwar unter Belassung des Erreger- und Sperrfilter-Sets zur Blaulichtanregung. Der Sperrfilter (Langpass-Filter) lässt hier nur Wellenlängen ab 515 nm passieren, weshalb das Hellfeldbild leicht grün gefiltert erscheint. Möglicherweise wurden hierdurch potenzielle Abbildungsrestfehler, die bei Wasserverwendung zum Tragen kommen können, infolge des engeren optisch wirksamen Spektralbereiches mit Grünlicht-Dominanz mehr reduziert als im ungefilterten Weißlicht.

Vielleicht hat auch das Objektiv bei einer Vergrößerung von "nur" 40 fach bei NA 1,4 so hohe Qualitätsreserven, dass die Verluste durch Wasserverwendung nicht so sichtbar ins Gewicht fallen bzw. weniger gravierend sind als bei 60 oder 63 facher Vergrößerung (Herr Kauer und Rene hatten ja mit 60- bzw. 63x-Objektiven gearbeitet).

Im speziellen Fall ist die Verwendung des Wassers auch deshalb für mich interessant, weil das Ölimmersionsobjektiv zusammen mit einem Set von unterschiedlich vergrößernden Floureszenz-Wasserimmersionen verwendet wird. Im direkten Vergleich lieferte das Objektiv ÖL 40/1.4 überraschenderweise ein besseres Bild bei Wassereinsatz als entsprechende Wasserimmersionen 50/1.0 bzw. 100/1.2 des selben Herstellers bei bestimmungegemäßem Eintauchen in Wasser.

Herzliche Grüße in die Runde

Jörg Piper

peter-h

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Re: Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« Antwort #6 am: Januar 07, 2010, 18:30:39 Nachmittag »
Nun muß ich mich doch noch einmal melden.  ;)

Sicher sind solche Vergleiche von sehr vielen anderen Parametern als nur vom Medium Wasser/Öl abhängig. Ich wollte es nun einmal mit den üblichen Testdiatomeen versuchen. Objektiv ein CZJ Apo 100/1,32 Öl und dazu 2 bekannte Diatomeen.



Der Kondensor war bei Nitzschia sigma mit Wasser immergiert und auf NA 1,0 eingestellt, bei Pleurosigma angulatum nicht immergiert und auf NA 0,6 gestellt.
Ganz sicher ein harter Vergleich der je nach ausgewähltem Objekt auch weniger drastisch ausfallen kann. Wer eine Ölallergie hat der wird natürlich zum hochkomplexen Dihydrogenmonoxid greifen und die kleinen Schwächen akzeptieren.  ::)

Viele Grüße
P.Höbel

Rene

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Re: Ölimmersionen mit Wasser immergieren
« Antwort #7 am: Januar 07, 2010, 18:58:17 Nachmittag »
Hallo Peter,

Amazing difference! Especially at the higher illuminating apertures. Herr Kauer could not be serious to suggest water is, mwoh, ok for routine stuff. A proper dry lens does a better job.

So what would the amount of tube length correction needs to be, to correct for such outrageous spherical abberation, I wonder?

René