Auflicht-Fluoreszenz-Kombinationen mit DIC und Phaco im DL

[Holger Adelmann]

Liebe Kollegen,

ich habe mal wieder etwas in meinem Fundus gestöbert als ich letztes Wochenende ein paar Fluoreszenzaufnahmen gemacht habe.

Die Auflicht-Fluoreszenz lässt sich sehr elegant mit Durchlicht Phasenkontrast (Unser Mitglied Nomarski hat ja auch schon hierüber gepostet), aber auch mit Durchlicht DIC kombinieren - trotz der beim letzteren gegebenen Wollaston-Prismen und Polarisatoren.

Alle Aufnahmen entstanden an meinem Leitz Orthoplan mit Ploemopak, UV bzw Blauanregung durch einen HBO 50W Brenner

Zunächst Chironomus Polytänchromosomen - gleiches Bild, zunächst im Phaco ...



... dann unter Zuschaltung der Auflichtfluoreszenz. Die DNA des Chromosoms wurde mit DAPI, einem DNA-spezifischen Liganden, markiert.
Sehr schön sieht man die Konzentration der DNA in den lichtbrechenden Streifen des Chromosoms



Geht auch gut bei Ciliaten, die vorher mit DAPI-markierter Hefe gefüttert wurden. Beachte auch die Diffusion des DNA Farbstoffs in den Gross und Kleinkern - Lebendaufnahme !



Weniger oft sieht man vermutlich eine Kombination von Fluoreszenz mit DIC wie im nachfolgenden Präparat, wo ich die DNA im Zellkern von Fibrosarcoma-Zellen markiert habe:




Viel Spass beim Anschauen und herzliche Grüsse
Holger

[Michael Plewka]

hallo Herr Adelmann,
vielen Dank für diese Bilder, sowas habe ich in dieser Form bei den gezeigten Zellen noch nicht gesehen!
Während es bei dem Bild von Paramecium für mich durchaus vorstellbar ist, dass es sich um ein Lebendpräparat (sic!) handelt, ist dieses beim letzten Bild für mich nicht klar. Deshalb zwei Fragen
-müssen die Fibrosarcoma-Zellen für eine solche Darstellungsform fixiert werden?
-wurde hier eine Aufnahme bei gleichzeitiger Fluoreszenz und DIK gemacht oder ist das gezeigte Bild eine Montage aus Fotos von zwei unterschiedlichen Beleuchtungsverfahren?

beste Grüße Michael Plewka

[Holger Adelmann]

Hallo Herr Plewka,

ich gebe gern noch ein paar Details (hätte ich eigentlich gleich tun können  ):

Das schöne an den hier gezeigten simultanen Auflicht/Durchlichtverfahren ist, dass die Objekte genauso brilliant im Mikroskop zu sehen sind ! Es sind keine Doppelbelichtungen nötig.

Das Chironomus Chromosom entstammt einer einfachen Quetschpräparation. Die Speicheldrüsen der Larve wurden zunächst in Alkohol-Eisessig 3:1 fixiert, nach 1 Stunde in 50% Essigsäure für weiter 30 min überführt und dann zwischen Objektträger und Deckglas gequetscht. Das Deckglas wurde dann nach Vereisen auf CO2 Schnee abgesprengt und der Objektträger dann in 100% Isopropanol gestellt und danach in der ansteigenden Alkoholreihe in dest. Wasser gebracht. Nun kann dann die DNA "Färbung" erfolgen durch Einstellen in wässrige DAPI Lösung, 100ng/ml, kurz mit Wasser abspülen und dann in Glycerin unter's Fluoreszenzmikroskop.

Die Fibrosarcoma Zellen sind in einer Zellkultur gewachsen, in die ein steriler Objektträger für einige Tage eingelegt wurde, damit die Zellen dort aufwachsen.
Der Objektträger wurde dann entnommen und in gepuffertes, neutrales Glutaraldehyd eingestellt, wo die Zellen fixiert wurden. Danach DAPI Färbung wie oben beschrieben.

Herzliche Grüsse
Holger Adelmann