Aufhellen von Chitin in Nelkenöl

[Gerd Schmahl]

Hallo,
hat jemand Erfahrung im Aufhellen von Chitinteilen in Nelkenöl?
Wie lange lässt man es einwirken und kann man die Aufhellung unterstützen, in dem man das Schnappdeckelglas mit den Objekten z.B. auf der Heizung warm lagert.

Im SCHLÜTER, W. "Mikroskopie für Naturfreunde und Lehrer" habe ich lediglich gefunden, dass man die Objekte aus 90%-igem Alkohol in das Nelkenöl überführen soll und dieses auch stark entwässernd wirkt.

Ich möchte gerne Flöhe zu Durchlicht-Präparaent verarbeiten, ohne in KOH oder NaOH zu mazerieren, was ich bisher sehr erfolgreich gemacht habe, aber dann sind halt keine Muskeln usw. mehr zu sehen. Hat jemand noch eine andere Idee?

Beste Grüße
Gerd

[liftboy]

Hallo Gerd,

genau! mit Nelkenöl hab ich das in meinen Anfängen auch versucht (das Zeug steht heut noch hier rum), Ergebnis wohlriechend aber enttäuschend. Mit Chloralhydrat, oder Chlorderivaten wirst Du warscheinlich besser zurechtkommen; braucht aber wie beim Öl seine Zeit. Mir ist nur aufgefallen, dass Insektenpräparate die ich in Hoyers Gemisch eingebettet hatte, mit der Zeit immer heller werden. In dem Gemisch ist Chloralhydrat. Der Nachteil von dem Zeug ist eine Kristall?bildung, nicht doppelbrechend, je nach dem was eingebettet wurde. Ein System oder eine Ursache hab ich noch nicht gefunden. Chloralhydrat alleine führt nicht zum Ergebnis.
Eau de Javelle oder Barraque funktioniert auch!

Grüße
Wolfgang

[Herbert Dietrich]

Hallo Gerd,

in "Mikroskopieren" empfiehlt Prof. Nachtigall: Meist ist das Chitin zu dunkel. Man überführt die Teile aus 70%igem über 94%igen in absoluten Alkohol (jeweils
für einige Stunden) und läßt dann für einige Tage in Methylbenzoat liegen: je länger, desto heller werden die Teile. Statt Methylbenzoat kann man auch Xylol nehmen, aber da sorgfältig über absoluten Alkohol entwässern.

Auch Stehli empfiehlt Methylbenzoat.

Einfach mal ausprobieren.

Herzliche Grüße
Herbert

[Aljoscha]

Hallo,

Romeis (1989, 467) nennt neben anderen Chlordioxid-Gemischen auch eine wässrige Lösung von Chlordioxid. Die ist stabil, relativ ungefährlich und im Handel problemlos zu bekommen. Vielleicht tut es das Zeug ja. Selbst habe ich aber keine Erfahrung damit.

Viele Grüße

Alexander

[momotaro]

Dear Gerd - How to Mount Your Flea:

How to Mount Your Flea ,A GUIDE TO THE PRESERVATION, PREPARATION , CLEARING, AND MOUNTING OF SIPH ONAPTERA
https://www.ocvector.org/files/ad90bd7e8/How_To_Mount_Flea.pdf


Flea'in Around: A Look at the Identification, Preservation, Clearing, and Mounting of Siphonaptera
https://escholarship.org/content/qt49z937pk/qt49z937pk.pdf?t=q3ukc4


Brigham Young University (BYU) The College of Life Sciences Fleas of the World:
https://biology.byu.edu/fleas-of-the-world

Snodgrass, R. E. 1946. The skeletal anatomy of fleas (Siphonaptera). The Smithsonian Institution, Washington, D.C.
https://repository.si.edu/bitstream/handle/10088/22789/SMC_104_Snodgrass_1946_18_1-89.pdf

LG Helmut

[B.Neuhaus]

Guten Abend Gerd,

im Prinzip gibt es zwei Möglichkeiten, Strukturen besser sichtbar zu machen: entweder Du hellst Deine Präparate optisch auf und maskierst Gewebeteile damit oder Du zerstörst chemisch Gewebeteile (= Mazeration). Es wird bei den bisher gegebenen Antworten nicht immer so ganz klar, welcher Kategorie die vorgeschlagene Lösung zuzuschlagen ist.

Bei den aufhellenden Chemikalien Nelkenöl, Methylbenzoat und Xylol (letzteres härtet Präparate stark, kann also bei empfindlichen Strukturen zum Bruch des Präparates führen) soltest Du im Hinterkopf behalten, dass diese Stoffe über eine längere Zeit (Monate bis Jahre) auch verdunsten und damit die aufhellende Wirkung nachlässt. Ein Deckglasumrandungslack setzt der Verdunstung nur sehr eingeschränkt Grenzen.

Mazerierende Chemikalien wie KOH und Hoyer's Medium lösen je nach Konzentration und Einwirkungszeit zunächst die weicheren Bestandteile auf und später auch die härteren. Bei KOH geht das Ganze recht fix, bei Hoyer's kann es Wochen, Monate oder Jahre dauern. Irgendwann sind die Präparate dann allerdings "weg" weil komplett chemisch zerstört. Man kann die Mazeration nach einer gewissen Zeit stoppen, indem man die Präparate zunächst mehrfach in Wasser wäscht (oder bei KOH zunächst mit etwas Säure neutralisiert) und dann in ein neutrales Medium wie Glycerin überführt.

Wenn es Dich brennend interessieren sollte, ich habe diese Zusammenhänge vor ein paar Jahren mal beschrieben, mehr Chemikalien genannt und auch beispielhaft ausgerechnet, wie schnell Moleküle in Einschlussmedien wandern können (Neuhaus et al. 2017, Open Access unter http://www.mapress.com/j/zt/article/download/zootaxa.4322.1.1/12414).

Viele Grüße und erhellende Präparate,
Birger

[Gerd Schmahl]

Hallo,
besten Dank für die Hinweise!
Special thanks to Helmut for the wonderful links!!! The first one will help me the most, but also the website  "Fleas of the World" is great.

Beste Grüße
Gerd

[Gerd Schmahl]

Hallo Birger,
Deine Antwort kam, während ich meine letzte formuliert haben. Es geht mir nicht um Mazeration. Das beherrsche ich inzwischen sehr gut. Ich koche ca, 10min in NaOH, nach dem die Flöhe 1..2 Tage in der Lauge lagen und dann wird mit gesäuertem Wasser (ein paar Spritzer HCl) gespült und dann noch mit Aqua dest. Danach gehts die Alkoholreihe hoch und über Xylol in MALINOL. Das klappt wunderbar.

Nein mir geht es wirklich um das Aufhellen der Chitinhülle, um die Innereinen, besonders die Muskeln bei gekreuzten Polarisatoren betrachten zu können, wie in diesem 30 Jahre alten Präparat in Histokit.
LG Gerd

[momotaro]

Hi Gerd,

Clearing pigmented insect cuticle to investigate small insects' organs in situ using confocal laser-scanning microscopy (CLSM)

a b s t r a c t
Various microscopic techniques allow investigating structures from submicron to millimeter range,
however, this is only possible if the structures of interest are not covered by pigmented cuticle. Here, we
present a protocol that combines clearing of pigmented cuticle while preserving both, hard and soft
tissues. The resulting transparent cuticle allows confocal laser scanning microscopy (CLSM), which
yields high resolution images of e.g. the brain, glands, muscles and fine cuticular structures. Using a
fluorescent dye, even single labeled neurons can be visualized and resolved up to an imaging depth of
150 mm through the cleared cuticle. Hydrogen peroxide, which was used to clear the cuticle, does not
preclude immunocytochemical techniques, shown by successful labeling of serotonin immunoreactive
neurons (5HT ir) in the ants' brain. The 'transparent insect protocol' presented here is especially
suited for small arthropods where dissection of organs is very demanding and difficult to achieve.
Furthermore, the insect organs are preserved in situ thus allowing a more precise three dimensional
reconstruction of the structures of interest compared to, e.g., dissected or sectioned tissue.

https://kops.uni-konstanz.de/entities/publication/88eeb1ed-8845-4ea7-802f-1058ae04fabb

Marcus Stüben, Karl Eduard Linsenmair (2009): Advances in insect preparation: bleaching, clearing and relaxing ants (Hymenoptera: Formicidae). – Myrmecological News = Myrmecologische Nachrichten – 012: 15 - 21.

Abstract:
Myrmecologists use a variety of methods for clearing (macerating) and relaxing ants. Bleaching, however, has virtually never been applied in morphological studies. Here we describe a combination of a common bleaching treatment of insect cuticle with hydrogen peroxide and a subsequent clearing of adhering soft tissues with either lactic acid or proteolytic enzymes. This technique allows viewing of the internal morphology of ants without dissection. The resulting glassy specimens reveal valuable morphological characters and may be used as three-dimensional morphological maps to guide the dissection of additional specimens. Bleached specimens are thus particularly useful as teaching material. Positive side effects of the treatment are the extension of (a) retracted mouthparts, (b) sting apparatus and (c) armatures of the male genitalia. An underwater preparation procedure with subsequent fan drying is also described for relaxing specimens preserved in absolute ethanol. Based on tests of relaxing methods, a much less harmful but equally effective modification of the carcinogenic Barber's fluid is described for relaxing and cleaning purposes of pinned or card-point mounted specimens.

https://www.zobodat.at/publikation_volumes.php?id=32859


Clearing and dissecting insects for internal skeletal morphological research with particular reference to bees

Abstract

A detailed protocol for chemical clearing of bee specimens is presented. Dry specimens as well as those preserved in liquid media can be cleared using this protocol. The procedure consists of a combined use of alkaline solution (KOH or NaOH) and hydrogen peroxide (H2O2), followed by the boiling of the cleared specimens in 60–70% EtOH. Clearing is particularly useful for internal skeletal morphological research. This procedure allows for efficient study of internal projections of the exoskeleton (e.g., apodemes, furcae, phragmata, tentoria, internal ridges and sulci), but this process makes external features of the integument, as some sutures and sulci, readily available for observation as well. Upon completion of the chemical clearing process the specimens can be stored in glycerin. This procedure was developed and evaluated for the preparation of bees and other Apoidea, but modifications for use with other insect taxa should be straightforward after some experimentation on variations of timing of steps, concentration of solutions, temperatures, and the necessity of a given step. Comments on the long-term storage, morphological examination, and photodocumentation of cleared specimens are also provided.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0085562615001338?ref=pdf_download&fr=RR-2&rr=797c51ab48aec4bd

LG Helmut

[B.Neuhaus]

Lieber Gerd,

das habe ich Deinem ersten Post schon entnommen, dass Du möglichst nicht mazerieren möchtest. Da aber mehrere Antworten genau das (also die Mazeration mit Hoyer's, Chloralhydrat, dem giftigen Chlordioxid) vorgeschlagen haben, habe ich auf den Unterschied zum rein physikalischen Aufhellen von Präparaten hingewiesen. Und auch die Vorschläge von Helmut kreisen um die Mazeration. Da mir nicht ganz klar war, ob eine leichte Mazeration für eine begrenzte Zeit vielleicht doch hilfreich sein könnte, habe ich dazu ebenfalls ein paar Zeilen geschrieben.

Eventuell könnte der Einschluss in Glycerin hilfreich sein, das maskiert Proteine etwas und hellt damit Präparate etwas auf. Wenn man das Präparat mit einer kleinen Menge Glycerin in einem Paraffinring auf dem Objektträger aufbringt, das Paraffin bei 58°C schmilzt und dabei das Deckglas vorsichtig andrückt und später mit Deckglasumrandungslack versiegelt, hat man ein Präparat, das Jahrzehnte lang hält.

Viele Grüße,
Birger