Ersatz für Alciangelb

[jako_66]

Hallo zusammen,

auf der Suche nach einem Ersatz für das Alciangelb habe ich mehrere gelbe Farbstoffe ausprobiert. Die in meinen Augen beste Alternative ist Titangelb (Thiazolgelb, CI 19540).

Auf den zweiten Blick sehen wir die negativen Ladungen der Sulfonatgruppen beim Titangelb, wo Alcianblau positive Isothiouroniumgruppen wegen der Löslichkeit enthält. Das könnte entscheidend sein. Im ungünstigsten Fall verklumpt die Mischung der Farbstoffe - ja, das tut es leider auch, stärker noch mit Astrablau!
Aber sequentiell nach Etzold FCA oder Wacker gefärbt ergeben sich mit einer 0.5%ig wässrigen Titangelblösung für 2 min bei Raumtemperatur schöne einheitliche Grüntöne!

Das Rezept:

•   Entparaffinierte Schnitte gründlich in Aqua dest. spülen
•   Neufuchsin-Chrysoidin-Farblösung 5-8 min. gelegentlich schwenken
•   kurz abspülen in Aqua dest.
•   in zwei Portionen Ethanol 30%ig abspülen (je 30 s)
•   in Ethanol 70%ig differenzieren (ca. 30-120 s)
•   in zwei Portionen Ethanol 30%ig abspülen (je 30 s)
•   abspülen in Aqua dest.
•   Alcianblau-Färbelösung 2min mit einmaligem Erwärmen auf ca. 60°C
•   gut abspülen in Aqua dest.
•   Titangelb-Färbelösung 2min
•   gut abspülen in Aqua dest.
•   Entwässern in 3-4 Portionen abs. Isopropanol (je 1 min)
•   je nach Einschlussmittel über Xylol oder gleich in Euparal einschließen

Ansätze:

•   Neufuchsin-Chrysoidin-Farblösung: 10 mg Neufuchsin und 20 mg Chrysoidin werden in 98 ml dest. Wasser und 2 ml Eisessig gelöst und filtriert, dann mit einigen Kristallen Thymol versetzt. Der Ansatz ist 0.01%ig bezogen auf Neufuchsin und 0.02% bezogen auf Chrysoidin
•   Alcianblau-Farblösung: 0.2%ige Lösung von Alcianblau in sterilem Wasser incl. 2% Eisessig filtrieren, Zugabe von wenigen Kristallen Thymol
•   Titangelb-Farblösung: 0.5%ige Lösung von Titangelb in sterilem Wasser 2-3 h bei ca. 45°C rühren, über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen lassen und filtrieren (dauert). Anschließend zu 10% mit sterilem Wasser verdünnen (beugt Ausfällungen infolge Temperaturerniedrigungen vor), Zugabe von wenigen Kristallen Thymol. Ansatz ohne Eisessig!

Literatur: http://www.aeisner.de/methoden/farb70.html nun weiter modifiziert, da taugliches Alciangelb vom Markt verschwunden ist (pdf letzter Anhang oder aktualisiert http://www.mikrohamburg.de/Tips/2023_Hamburger%20Faerbung%20(NCAT).pdf)

Mit einem Preis von 19 € pro 10 g ist Titangelb "gerade noch" erschwinglich, z.B. bei https://www.omikron-online.de

Nachfolgend gezeigte Schnitte wurden bis auf das Bild mit dem Astrablau im gleichen Uhrglas mit FCA sequenziell gefärbt, nach dem Alcianblau 2 min mit Titangelb bei Raumtemperatur. Sicher gibt es besser geeignete Proben als im Januar abgeschnittene Baumzweige und das Messer war auch nicht im besten Zustand ...

Viele Grüße


Sven

[Fahrenheit]

Lieber Sven,

das sieht sehr gut aus!

Schade, dass die Herstellung der Titangelb-Lösung etwas aufwändiger ist.

Herzliche Grüße
Jörg

[Aljoscha]

Titangelb-Farblösung: 0.5%ige Lösung von Titangelb in sterilem Wasser 2-3 h bei ca. 45°C rühren, über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen lassen und filtrieren (dauert). Anschließend zu 10% mit sterilem Wasser verdünnen (beugt Ausfällungen infolge Temperaturerniedrigungen vor), Zugabe von wenigen Kristallen Thymol. Ansatz ohne Eisessig!

Hallo Sven,

Die Bilder sehen ja sehr vielversprechend aus. Leider stehe ich etwas auf der Leitung und komme mit deiner Anleitung zur Herstellung der Titangelblösung nicht klar. Was bedeutet "zu 10 % mit sterilem Wasser verdünnen" genau? Sollen 10 % zugesetzt werden oder soll die Lösung auf 10 % der Ausgangskonzentration verdünnt werden?

Danke und viele Grüße

Alexander

[jako_66]

Hallo Alexander,

im Keller habe ich eine Wasserreinigungsanlage, wo quasi keimfreies Wasser rauskommt und von der Leitfähigkeit hat es fast den Status "destilliert". Du kannst auch das übliche "destillierte" Wasser vom Drogeriemarkt nehmen.

Zur Verdünnung nach der Filtration: je nach Literatur löst sich Titangelb in Wasser so gut wie gar nicht oder doch einigermaßen. Letzteres ist der Fall, vorausgesetzt, es liegt als Di-Natriumsalz vor. Die 10%ige Verdünnung habe ich sicherhaltshalber so gemacht, falls man doch mal bei Raumtemperatur die Lösung ansetzt und diese dann in den Keller stellt. Aufgrund der begrenzten Löslichkeit könnte u.U. Feststoff ausfallen (habe ich aber nicht beobachtet). Seit der Eisen-Gallussäure-Tannin-Färbung bin ich sehr sensibel auf dunkle Punkte im Schnitt geworden.

Da mit einem Überschuss an Titangelb gefärbt wird, kommt es nicht so sehr auf die Konzentration an. Vielleicht funktionieren verdünnte Ansätze sogar noch besser - das habe ich aber noch nicht probiert.

Wer selber filtriert, sollte wirklich über Nacht stehen lassen. Dann filtrieren sich 4/5 sehr schnell durch einen Faltenfilter. Heute habe ich nur einen gebraucht, vor 2 Wochen waren es mehr...

Viele Grüße

Sven

[Bob]

Hallo Sven,
mir gefällt das Ergebnis der Färbung sehr gut. Beim Vergleichs-Etzold-blau scheint mir das Fuchsin etwas zu kurz zu kommen, für einen fairen Vergleich müsste man evtl. noch mal gucken, ob man die blaue Variante ausgewogener hinbekommt.
Lässt sich die Löslichkeit des Titangelbs verbessern, ohne inkompatibel mit den anderen Komponenten der Färbung zu werden, pH-Wert, etwas Ethanol?

Viele Grüße,

Bob
 

[jako_66]

Hallo Bob,

beim FCA habe ich mich an die Angaben von Aeisner gehalten. Sicher könnte man mehr Neufuchsin reinschaufeln. Etzold-FCA ist super geeignet, um verschiedene Gewebearten unterschiedlich anzufärben. Geniale Bilder finden sich u.a. im Buch von Bernd Miggel "Holzbestimmung mit dem Mikroskop". Mich interessieren aber eher Färbungen, bei denen man nicht differenzieren muss (kein Stereomikroskop im Keller, Lupe reicht nicht). Die Variation Etzold-Blau können wir uns ja beim nächsten Mikro-Treffen am 18.3.23 vornehmen?

10% Ethanol-Zugabe zur Titangelb-Lösung hatte ich auch überlegt, ist aber nicht nötig. Den Effekt auf Chrysoidin kann ich nicht abschätzen. Wenn beim Färben saure Bedingungen vermieden werden, ist Titangelb unkritisch und kinderleicht anzuwenden. Jede Eintopffärbung incl. Titangelb ist wegen der negativen Ladungen der Sulfonatgruppen von vornherein zum Scheitern verurteilt. Es geht nur Alcianblau gefolgt von Titangelb.

Viele Grüße

Sven

[Fahrenheit]

Lieber Sven,

am Wochenende und heute habe ich einige Färbeversuche mit Titangelb gemacht:
- Safranin, Diamantfuchsin und Chrysoidin mit Alcianblau und Titangelb (aus Ermangelung einer Neufuchsin-Chrysoidinlösung)
- Rhodamin B und Chrysoidin mit Alcianblau und Titangelb (sehr schön!), sowie
- Acridinrot, Acriflavin mit Alcianblau und Titangelb (basierend auf der Wackerfärbung).

Aufnahmen dazu folgen bald.

Dabei ist mir aufgefallen, dass im Rezept zum Hamburger Grün die Färbestufe mit Alcianblau erhitzt wird. Das macht m.E. keinen Sinn, da die Wärme dazu dienen soll, das Chrysoidin - oder Acriflavin - besser auf z.B. das Wachs der Cuticula aufziehen zu lassen. Ist da eventuell ein Fehler in der Dokumentation?

Da meine Safranin Diamantfuchsin Chrysoidin Lösung wohl schon bessere Tage gesehen hat und kaum noch anfärbt und sie eh nicht dem Original-Rezept entspricht: dürfte ich Dich bitten, einige Querschnitte vom Blattstiel des Efeus mit Hamburger Grün zu färben und hier einzustellen? Wir hätten dann einen schönen Vergleich.

Herzliche Grüße
Jörg

Nachtrag 14.03.2023:
Ich habe die Dokumentation zur von mir verwendeten Safranin Diamantfuchsin Chrysoidin Lösung gefunden: sie ist auf mindestens 2h Färbedauer ausgelegt - gerne auch bis 24h - und gehört eigentlich zu einer experimentellen Fünffachfärbung, die Rolf-Dieter Müller in 2019 als Ersatz für die Acridinrot-basierenden Färbungen "gebraut" hat.
Von gestern auf heute habe ich damit für gut 20h gefärbt und das Ergebnis schaut sehr gut aus.

Als kleiner Teaser hier 3 Bilder, die ich von den frisch eingedeckten Schnitten gemacht habe, da die Färbung der Cuticula oft schon beim Trocknen der Präparate auf der Wärmeplatte verblasst:


Färbung mit der Safranin Diamantfuchsin Chrysoidin Lösung, Alcianblau und Titangelb, drei Färbestufen, Lösungsgemisch mit Chrysoidin erhitzt


Färbung mit Rhodamin B, Chrysoidin, Alcianblau und Titangelb - 4 Einzelfärbungen, Chrysoidinstufe erhitzt


Färbung mit Acridinrot, Acriflavin, Alcianblau und Titangelb - 4 Einzelfärbungen, Acriflavinstufe erhitzt

[jako_66]

Lieber Jörg,

klasse Aufnahmen, die Du da hingezaubert hast! Es freut mich, dass die Grünfärbung reproduzierbar ist - und Färbeprofis bekommen einfach die besseren Bilder hin!

Da Alcianblau in der Histologie als selektive Färbung für polyanionische Strukturen (saure Glycosaminoglycane, Chondroitinsulfat, Hyaluronsäure, etc.) verwendet wird, hängt die Färbewirkung stark von der Konzentration, pH-Wert, Gewebepermeabilität (Temperatur!) und der Ionenstärke von 2-wertigen Metallkationen ab. Absorptionsspektren legen ein Aggregat auch in niedrigen Konzentrationen nahe, wahrscheinlich ein Stapel von 2-3 Alcianmolekülen. Daher habe ich immer bei den 2-minütigen botanischen Färbungen 20-30 s bei ca. 60°C erwärmt, um diese Aggregate zu (etwas) lösen, damit die Moleküle tiefer in die zu färbende Schicht eindringen können. Deine Fotos, zeigen dass dies wahrscheinlich nicht nötig ist, bzw. besser beim Chrysoidin/Acriflavin aufgehoben ist (wußte ich bisher nicht).

Am Wochenende haben wir ein Mikro-Treffen in Hamburg. Erst danach komme ich dazu, Efeu neu zu schneiden und zu färben. Fotos folgen.

Viele Grüße

Sven

[Fahrenheit]

Lieber Sven,

danke Dir! Aber ein krautiger Blattstiel ist ne ganz andere Nummer als ein verholzter Spross, da kommen die Parenchyme viel besser zur Geltung, da sie einen wesentlichen größeren Anteil am Durchmesser haben. Und an denen zeigt sich ja gerade das Grün. Deine Schnitte sind ebenfalls gut gelungen und zeigen andere Aspekte der Färbung, z.B. die gelb gefärbten Sklerenchymzellennester.

Ich nehme immer den Efeublattstiel, um hiermit vergleichen zu können:
http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanische_mikrotechnik/303.html

Das Auflösen der Alcianblau-Stapel ist ein interessanter Aspekt, den ich gar nicht kannte. Danke, ich werde es mal mit Erwärmen beider Teilfärbungsbäder versuchen.
Viel Spaß beim Treffen und ich freue mich auf Deine Schnitte / Bilder!

Herzliche Grüße
Jörg

[Florian D.]

Hallo,

Was ist eigentlich der Hintergrund dieses Fadens?
Ist Alciangelb denn nicht mehr erhältlich?

Viele Grüsse
Florian

[jako_66]

Hallo Florian,

vielleicht tut jemand noch eine Quelle für (bezahlbares) Alciangelb als Feststoff auf - beim Acridinrot 3B hatte es geklappt (bezahlbar ist relativ...). Dann könnte man wieder eine Eintopffärbelösung ansetzen.

Bis es soweit ist: Titangelb 10 g für ca. 19 €

Viele Grüße

Sven

[Fahrenheit]

Lieber Florian.

da spielt auch die Formulierung des Alciangelb eine Rolle: Klaus Hermann und ich haben in 2018 Alciangelb aus drei Quellen (zu den bekannten Preisen ) getestet und mit keiner Charge ließ sich im Zusammenspiel mit Alcianblau das bekannte Alciangrün darstellen.

Auch wenn Alciangelb wieder erhältlich sein sollte, ist nicht garantiert, dass der Farbansatz funktioniert. Und für einen Schuß ins Blaue find ich > 100 Euro für 10 Gramm (der letzte mir bekannte Preis) einfach zu teuer. Zumal die Farbwirkung mit der Nachfärbung mit Titangelb z.B. sehr nah an das alte Etzold Grün kommt.

Herzliche GRüße
Jörg

[MiR]

Hallo Jörg,

gut, dass du ein paar Hintergrundinformationen offenlegst. Ist eigentlich bekannt woher das ehemals "funktionierende" Alciangelb stammt, und welche Informationen sind dazu noch verfügbar?
Bzw. welche Informationen sind hinsichtlich der "drei Quellen" bzw. der von dort bezogenen Substanzen verfügbar?

Das Problem bei Farbstoffen (genau genommen nicht nur bei Farbstoffen ...) ist gelegentlich die Angabe aller Inhaltsstoffe.  Z.B. im Fall der Ware von Sigma-Aldrich, enthielt das Produkt mit der Nummer A7394 (siehe Sven's Antwort) einen Farbstoffgehalt von 70%. Nehmen wir das Produkt mit der Nummer 121282 sind es nur noch 60% Farbstoff. So steht es auch in den jeweilgen allg. Analyseprotokollen.
Da sind also 30%-40% weitere Substanz(en) enthalten ...

Vielleicht ist es noch möglich, erst einmal herausfinden woraus das funktionierende Material besteht ...

Viele Grüße aus Berlin
Michael

[Fahrenheit]

Lieber Michael,

nein, über die Bezugsquellen ist mir nichts mehr bekannt. Das Missgeschick mit dem nicht funktionierenden Alciangelb ist vor 15 Jahren oder so schon einmal passiert und Klaus hatte seinerzeit die Lösung gefunden und darüber gibt es m.E. auch einen Artikel im Mikrokosmos.

Irgendwann klappte es dann mit einer aus der seinerzeit verwendeten Quelle bezogenen Charge wieder nicht mehr und Klaus hat noch zwei weitere Chargen (eine war glaub' ich von privat aus England) dazu gekauft: alles nix.
Da das ganze ein recht teurer Spaß war und wir auch zusammen mit viel Pröbeln nichts funktionierendes mehr hin bekommen haben, hat Klaus das Thema fallen lassen.
Klaus war übrigens Vollchemiker - der wusste, was er tat.

Natürlich ist es möglich, dass ein eventuell noch existierender Produzent wieder die "richtige" Rezeptur für uns Mikroskopiker erstellt, aber bei den Preisen ...

Herzliche Grüße
Jörg

p.s.
Weiter oben im Faden hier hatte ich meine eigenen Ergebnisse schon angeteasert, da das ganze aber recht umfangreich geworden ist, habe ich einen eigenen Thread eröffnet: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=46074.0