Mord im Gartenteich (Kaulquappe quer)

[Ole]

Hallo,
im vergangenen Jahr war der heimische Gartenteich reichlich von Kaulquappen bevölkert. Diese lockten entsprechend auch die Jäger an, z.B. Gelbrandkäferlarven, die regelmäßig die Kaulquappen schlugen. Aber es gibt immer noch einen größeren Räuber, in diesem Falle lauerte Homo mikroskopiensis am Ufer und schnappte sich gleich beide, die Insektenlarve und die von ihr erlegte Beute. Und da dieser Räuber seine Beute scheibchenweise unter Deckglas bevorzugt, lagern beide jetzt im Harz erstarrt.
Seit Kurzem beschäftige ich mich ein wenig mit Histologie und möchte daher gerne die ersten Bilder hier zeigen. Da ich aber noch ganz am Anfang stehe (ist auch wörtlich zu nehmen: Bei der Kaulquappe bin ich erst bis zum Auge gekommen), bin ich für Verbesserungsvorschläge und Tipps immer offen. Die Beiträge im Forum in der letzten Zeit waren schon mal recht hilfreich.

Zur Methode:
1.) Die Tötung der Froschlarve erfolgte durch die Larve des Gelbrandkäfers (ich war es nicht gewesen  )
2.) Fixierung in AFE (9 Monate, also wohl "etwas überfixiert")
3.) Alkoholreihe (50% Spiritus (3x), 75% Spiritus (3x), 90% Ethanol (2x), Isopropanol (3x); jeweils mind. 48h)
4.) Paraffin-Isopropanol (1:2; 24h, 58°C), Isopropanol danach 24h abdunsten lassen
5.) Paraffin (24h, 58°C, 2x)
6.) Block gießen. Als Schälchen diente mir dazu das Inlay einer leeren "Mon Cheri"-Schachtel (der Block läßt sich anschließend sehr gut wieder entfernen)
7.) Schneiden am Rotationsmikrotom (Querschnitte)
8.) Entparaffinieren in Roti-Histol
9.) Absteigende Alkoholreihe
10.) Färbung
11.) Über Isopropanol und Roti-Histol Einschluß in Histokitt


Kopfbereich der Kaulquappe (cranial, Übersicht), Triazid nach Ehrlich (Rezept steht auf Herrn Eisners Homepage: http://www.aeisner.de/). Knorpelige Strukturen sind blau gefärbt. Die Zähnchen der Froschlarve sind gut zu erkennen (siehe z.B. rechten gelben Rahmen).


Hier eine stärkere Vergrößerung der Hornzähnchen (Stack aus 5 Ebenen)


Auffällig war die recht hohe Anzahl von Mitosen im Knorpelgewebe.


Hier noch eine stärkere Vergrößerung einer Mitose, die günstig zur Schnittebene lag. Chromosomen, Spindeln und Centrosomen sind gut zu erkennen.

Einige Schnitte weiter wurden dann die Augen vom Mikrotom erfaßt. Leider waren die Augen während der langen Aufbewahrungszeit im AFE schon etwas eingefallen, was auch die Lage der Linse erklären könnte.

Hier eine Übersicht


Auf diesem Bild ist im oberen linken Quadranten ein Blutgefäß getroffen, die kernhaltigen Erythrozyten sind orange gefärbt.

Mal sehen, was die nächsten Schnittserien zeigen.

Viele Grüße,
Ole

[Jürgen H.]

Lieber Ole,

mein Gratulation! Um so weit zu kommen, habe ich einige Monate und viele vergebliche Versuche gebraucht....

Ich denke, die Schrumpfung entsteht nicht durch langes Liegen im AFE sondern eher durch die Paraffineinbettung. Vorstellen könnte ich mir auch, dass die Lücken im Präparat beim Strecken der Schnitte entstehen. Die Schnitte müssen zwar gut gestreckt werden, sonst haften sie nicht und liegen nicht plan. Andrerseits besteht die Gefahr, dass die Schnitte, zu sehr und zu plötzlich gestreckt, so auseinanderziehen, dass sie an einigen Stellen reißen.

Wie ist Dein Färbeprotokoll?

Mikrogrüße

Jürgen

[Ole]

Hallo Jürgen,
vielen Dank für Deine Hinweise. Das Strecken der Schnitte erfolgt bei mir z.Zt. noch in einem einfachen Behälter ohne echte Temperaturkontrolle (warmes Wasser aus Leitung mit "Finger-Temperaturkontrolle"). Die gestreckten Schnittserien nehme ich danach mit dem Objektträger auf (ich strecke also nicht auf dem Objektträger). Zu warmes Wasser hat mir auch schon einige Serien zerlegt. Ich denke aber, dass Du in diesem Falle mit der Paraffineinbettung richtig liegst. In einigen Bereichen im Präparat (im Paraffinblock) sind ebenso wie in den Schnitten leere Bereiche (auch ohne Paraffin) vorhanden, sodaß die Infiltration wohl unzureichend war. Ich habe noch eine zweite Froschlarve im Isopropanol, die das gleiche Schicksal ereilt hat. Ich werde einmal eine Infiltration mit "echtem" Intermedium ausprobieren, vielleicht funktioniert das besser.

Hier das Färbeprotokoll:
1.) Entparaffinieren in Roti-Histol
2.) 2min Isopropanol abs.
3.) Alkoholreihe (mit Brennspiritus: 70%-50%-25% (je 1min) -Aqua dest.)
4.) Auftropfen von Triazid nach Ehrlich, 5min Raumtemperatur
5.) kurz spülen in angesäuertem Wasser (ich habe hier eine "Spatelspitze" Zitronensäure zu 50ml Aqua dest. gegeben)
6.) kurz spülen in 85% Isopropanol
7.) Isopropanol abs. (1min)
8.) Roti-Histol (2min)
9.) Einschluß in Histokitt

Hier noch das Protokoll zur Herstellung der Farblösung:
Methylgrün: 1,7g
Fuchsin (Säurefuchsin): 2,1g
Orange G: 1,5g
In 50ml Aqua dest. lösen
2 Tage bei 35°C im Wärmeschrank lagern, gelegentlich umschütteln.
Filtrieren durch Faltenfilter
Diese Stammlösung mit einem Tropfen Essigsäure (10%) ansäuern

Diese Lösung wird noch 1:20 mit Aqua dest. vor Gebrauch verdünnt (Aqua dest. ist bei meinen Protokollen immer demineralisiertes Wasser aus dem Baumarkt).

Diese Triazid-Färbung ist etwas eine Notlösung gewesen, da ich dafür alle Farbstoffe zur Verfügung hatte und andere Färbungen versagten. Bei der HE-Färbung färbte nur das Hämalaun (Mayer), kaum jedoch das Eosin (0,1% mit und ohne Ansäuerung). Auch die Azanfärbung fiel sehr schwach aus, allerdings waren die Azan-Komponenten sehr alt. Und bei der Triazidfärbung färbte insbesondere die Methylgrünkomponente eher schwach (nicht im gezeigten Präparat). Hier habe ich etwas die Fixierung im Verdacht. Tatsächlich steht im Romeis (16. Auflage) zur Triazidfärbung, dass Carnoy oder Fixierung in Sublimatgemischen die besten Ergebnisse erbringen. Zudem ist die Triazidfärbung laut Literatur sehr empfindlich gegenüber Alkali (eine Säurebehandlung der Objektträger, wie an verschiedenen Stellen vorgeschlagen, habe ich nicht durchgeführt). Die Zeit wird zeigen, wie stabil die Färbung in diesem Falle ist.

Viele Grüße,
Ole