DIY Auflichtfluoreszenz, verschiedene Filter, LED's

[Spectrum]

Ach und noch was, lieber Michael:
Deine Aufbauten sind ja der absolute Wahnsinn!
Das mußte ich mir heute morgen erstmal genüsslich zu Gemüte führen.
Absolut beeindruckend!
Steht da TTL auf dem Controller...?
Und für welchen Eisatzzweck genau werden diese Anlagen gebaut?
Neugierige Grüße Holger

[HCLange]

Hallo Holger,

die Lichtwege der Auflichtansätze mit Köhlerbeleuchtung dürften bei den Modellen Standard WL und Phomi/Universal gleich sein.

Herzliche Grüße
Christoph

[Spectrum]

Hallo Christoph,
Danke für deine Antwort.
Der vordere Teil beider köhlerbarer Auflichtkondensatoren sieht auch baugleich aus, aber bei dem Auflichtkondensor der umgebauten Universal/Phomi-Teil (3.) fehlt die Leuchtfeldblende und auch die Linse die in dem gewinkelten Ansatz des köhlerbaren Auflichtkondensor (2.) sitzt (siehe Katzenbild) fehlt.
Sind diese Teile eventuell im Inneren der Universal/Phomis verbaut?
Ich werde heute Abend nach der Arbeit mal mit einem Leuchtrohr+LED testen. Wie es geht hat mir Michael ja schon geschrieben:

Zitat:"Ob man den Fokus in die back focal plane geschafft hat, wird erkennbar, indem man das Anregungslicht an der Zimmerdecke ("quasi-unendlich") betrachtet und dort die Struktur des LED-die gut erkennt."

Dann sehe ich auch ob ein Abstand von ein paar cm die Abbildung an der Decke verändert...
Versuch macht klug...
LG Holger

[MS19]

Das ist ja mal eine große Hilfe was meine Pläne angeht. Vor allem deine praktischen Tips um die konjugierten Ebenen in den Griff zu bekommen sind wohl Gold wert. Dazu hätte ich dann auch gleich wieder ein paar Fragen an dich:
 Wenn ich mir meine Leuchtrohre 15 und meine verschiedenen Auflichtkondensoren so anschaue, dann beobachte ich das das Leuchtrohr bei eingeschobener LED diese in ein paar Metern scharf und  vergrößert auf der gegenüberliegenden Wand abbildet. Man erkennt den Umriss und die Struktur des Emitters:
Es scheint also eine Kollektoroptik mit großer Brennweite zu sein welches die Lichtquelle in großer Entfernung nahe Unendlich abbildet.

Grob-inhltlich stimme ich Dir zu: die Kollimation ist recht gut gelungen. Die Brennweite der Kollimations-Optik wird jedoch nicht notwendigerweise groß sein, sondern zum Abstand der LED von der Kollimationsoptik passend, so dass die Projektion einer nah an der Optik positionierten Lichtquelle an die Zimmerwand gelingt.

Sehe ich das richtig das dieses nahezu parallele Strahlenbündel eine gute Möglichkeit bietet hier einen Dichroid zur Strahlvereinigung einzubringen, ohne das die besagten konjugiertn Ebenen trotz zusätzlicher Weglängen, allzusehr von der ursprünglichen von Zeiss vorgesehenen Stelle abweichen?

Ja, die Schlussfolgerung ist zutreffend, da Du Dich dort im "quasi-unendlich-Raum befindest" und für einen Dichroiten zusätzlich eingebrachte Distanzen von 3-5 cm eine relativ geringe Auswirkung auf die Strahlführung haben werden. Der Dichroit selbst sollte natürlich geegenüber https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=370516 um 90° gedreht positioniert werden, so dass nicht die eine Lichtquelle in die andere scheint. ;-)

[MS19]

Steht da TTL auf dem Controller...?
Und für welchen Eisatzzweck genau werden diese Anlagen gebaut?

Zu a) TTL: ja, das steht TTL aber bitte die Abkürzung TTL="transistor-transistor logic" nicht mit TTL="through the lens" verwechseln. in meiner Vorrichtung ist die transistor-transistor logic gemeint und nicht eine Belichtungsautomatik seitens der Kamera.

Und für welchen Eisatzzweck genau werden diese Anlagen gebaut?

Insgesamt betreiben wir fast ausschließlich Lebendzellmikroskopie an Zellkulturen oder isolierten Zellverbünden bzw. Gewebeschnitten. Die Einsatzgebiete sind sehr unterschiedlich und reichen von der visuellen Beurteilung einer zellulären Fluoreszenz über quantitative Analysen der Einzelzell-Signale bis hin zu subzellulären Auflösungen schneller intrazellulärer Signalprozesse oder der Einzelmolekül-Spektroskopie.

Dies mit Amateur-haften DIY-Aufbauten zu vergleichen, wäre unfair, da wir bei Filtern, Objektiven und insbesondere bei den Kameras im obersten Segment unterwegs sein dürfen. Bei den Fluoreszenz-Anregungen hingegen sind die meisten unserer Aufbauten im low-cost-Bereich angesiedelt und mit etwas technischem Verständnis auch durch interessierte Laien realisierbar. Ja, wir haben und nutzen auch kommerzielle Lichtquellen wie Lumencor Sola, Spectra oder Celesta (Preissegmente zwischen 8.000 und 42.000 €), aber bei bestimmten Wellenlängen sind LED im Preissegment von 3-30 € in keinster Weise unterlegen. Dies in größerer Breite nutzbar zu machen, sollte IMO hier das Ziel sein.

[Spectrum]

Der Dichroit selbst sollte natürlich geegenüber https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=370516 um 90° gedreht positioniert werden, so dass nicht die eine Lichtquelle in die andere scheint. ;-)

Da hast du natürlich vollkommen recht, hab ich beim Erstellen der Bildbeschriftung vermasselt, und nicht bemerkt. Ich hab's inzwischen korrigiert. Sorry

[Spectrum]

Hier meine ersten Versuche mit meinen zwei köhlerbaren Kondensoren.
Der Auflichtkondensor wirft dabei auf Anhieb ein Abbild des LED-Emitters an die Zimmerdecke, die Variante für das Phomi jedoch nicht:


Halte ich den Ansatz mit der Feldlinse in einigen Zentimeter Abstand davor so wie hier:

Dann funktioniert es auch mit dieser Variante:

Genug Raum um einen Dichroit unterzubringen scheint vorhanden zu sein...
Das schaue ich mir aber nochmal in Ruhe an. Dank Michael weiß ich ja jetzt welche Bedingungen erfüllt sein müssen.🙂
(Meine vorherige Aussage was die Brennweite der Kollektoroptik anging bezieht sich nicht auf die Abbildung nahe Unendlich, sondern darauf das das Abbild der LED relativ zur Entfernung nicht allzusehr vergrößert wird, also geringer Bildwinkel bzw. relativ große Brennweite der Kollektoroptik im Leuchtrohr. So war's gemeint.)

Sieht alles bisher so aus als ob das Vorhaben umsetzbar ist. Dann bräuchte ich nur noch einen Würfel mit dem ich die zwei Leuchtrohre im rechten Winkel einschrauben kann mit einer Aufnahme für den Strahlteiler.
Hm...

Danke
Holger

[Werner]

Eine erstaunlich aufwändige mächtige Arbeit, um an einige Anregungs-Wellenlängen-(Bereiche) für die Fluoreszenz zu kommen...
Mit einem anderen Ansatz könnte man das einfacher haben: Man nehme einen Breitbandstrahler (Xenon) und einen Monochromator zur Wellenlängenwahl. Mit 2 oder 3 Austrittsspalten kann man auch 2 oder 3 Wellenlängen simultan erhalten. Die Licht-Weiterleitung und Querschnittswandlung kann über Quarz-Lichtleitfasern (UV-Bereich) erfolgen. Damit entfallen auch die vielen teuren Farbteiler und die Konstruktion wird einfacher.

Das soll keine Kritik sein, nur eine Anregung - Werner

[Spectrum]

Hallo Werner,
Danke für den Hinweis auf den Monochromator.
Mit denen liebäugel ich auch schon eine ganze Weile...
Ich befürchte aber das dieser Lösungsansatz zwar superflexibel ist, was die Wahlmöglichkeit der Wellenlänge angeht (großer Pluspunkt).
Was die reine Lichtleistung angeht, dürfte der Monochromator aber selbst bei einer sehr starken Weißlichtquelle nicht mit einer guten LED/Filterkombination mithalten können (behaupte ich mal).
Und die ist, wenn man filmen will, oder Bewegungsunschärfe bei Fotos vermeiden will, allerhöchstens noch durch Apertur und/oder Kameraempfindlichkeit zu ersetzen.
Zum austüfteln der besten Filterkombination für ein bestimmtes Fluochrom ist so ein Monochromator aber bestimmt super. Ein zweiter Monochromator als Sperrfilter noch besser.
Aber das sind alles nur Vermutungen.
Vergleichsbilder zwischen einer Monochromator- und einer Interferenzfilterlösung im direkten Vergleich wären echt mal interessant...
Grüße Holger

[Spectrum]

Beitrag gelöscht, da im falschen Faden gepostet.

[Werner]

@Holger:
Die Lichtstärke von UV-Monochromatoren hängt von Spiegelgröße ab. Ein Taschenmonochromator kann da nicht viel liefern.
Vor 50 Jahren gab es mal bei Perkin-Elmer Fluoreszenzgeräte für 10-mm-Küvetten in groß und teuer und in einfach. Lichtquelle jeweils 150-W-Xenon. Die einfachen waren nur etwa 30x30x25 cm groß und hatten doch zwei motorgetriebene Monochromatoren (Excitation und Emission) und waren doch narrisch hell. Die Spektralauflösung mit 2-10 nm reicht für die doch breiten Banden in Lösung.
Heute könnte man die noch einfacher und lichtstärker bauen, weil es Konkavgitter gibt, die keine weiteren Hohlspiegel brauchen. In kleiner gibt es komplette Geräte als HPLC-Detektoren.

Gruß - Werner

[Spectrum]

@Werner,
Deine "Anregung" (im wahrsten Sinne des Wortes) in Bezug auf die Benutzung eines Monochromators um verschiedene Wellenlängenbereiche abzugreifen hat ja, zumindest auf den ersten Blick, wirklich einiges für sich. Es müsste sogar möglich sein, nicht nur verschiedene Wellenlängenbereiche simultan für die Anregung abzugreifen (vorausgesetzt die Spaltblenden liegen weit genug auseinander um die zwei Lichtbündel dann auch effizient "einfangen" zu können).
In der Theorie könnte man darüberhinaus sogar über die Breite des Spaltes die Bandbreite des Anregungslichts anpassen...
Das klingt zumindest in der Theorie ja wirklich toll.
Trotzdem werden, soweit ich weiß für die klassische Fluoreszensmikroskopie (Auflicht/Weitfeld) wohl fast immer Interferenzfilter genutzt.
Auch die professionellen Aufbauten die Michael hier gezeigt hat, nutzen alle Interferenzfilter.
Ich frage mich ob es dafür (abgesehen vom viel einfacheren handling) auch noch weitere Gründe gibt...🤔
Kennt denn jemand einen Aufbau der für ein *bildgebendes* System einen solchen Monochromator einsetzt?
Ich kenne das eigentlich nur für Photometrische Messverfahren.
Inspirierte Grüße Holger

[MS19]

Auch die professionellen Aufbauten die Michael hier gezeigt hat, nutzen alle Interferenzfilter. Ich frage mich ob es dafür (abgesehen vom viel einfacheren handling) auch noch weitere Gründe gibt...🤔
Kennt denn jemand einen Aufbau der für ein *bildgebendes* System einen solchen Monochromator einsetzt?

Aber klar doch!
Der bekannteste Hersteller solcher Anregungs-Lichtquellen war TILL Photonics mit dem umtriebigen Münchner Biologen und Erfinder Prof. Rainer Uhl als Gründervater und Ideengeber. Die Geräte hießen "Polychrome" und kamen in 5 Generationen auf den Markt, von denen ich Generation 1, 2, 4 und 5 kenne und nutz(t)e. Der Gag bei diesen Geräten lag in der ultraschnellen Wellenlängen-Wahl durch Montage des diffraktiven Gitters auf einem galvanometrischen Scanner, der einen Ansprung jeglicher Wellenlänge zwischen ca. 320 nm und 680 nm innerhalb 2-4 ms erlaubte bzw. durch Anspringen von 280 nm eine "pseudo-Shutter-Funktion" aufwies. Die jüngsten Generationen Poly IV und Poly V arbeiteten mit 150 W Xenon-Kurzbogenlampen, die älteren mit 75 W Xenonlampen.

Warum schreibe ich das alles in Vergangenheitsform? Die Firma wurde 2008 verkauft und die Produktlinie durch die neuen Besitzer quasi instantan eingestellt. Das war´s dann leider ...
Zur Idealzeit hatten wir 5 dieser Systeme (unterschiedlicher Generationen) parallel in Betrieb, doch mit der Zeit legte der Elektronik-Tod eine nach der anderen Einheit lahm, so dass wir aktuell nur noch zwei regelhaft arbeitende Systeme und einen mit Analogansteuerung am Leben erhaltenen Monochromator weiterbetreiben können. Für die quantifizierende Mikroskopie haben die Systeme einen eklatanten Vorteil gegenüber DIY-LED-Anregungen: die Wellenlängen und Intensitäten sind extrem stabil und über Monate hinweg reproduzierbar, so dass bei zellbiologischen Untersuchungen kalibrierte Ca2+-Konzentrationsbestimmungen, genaue Bestimmungen von FRET (Förster-Resonanz-Energietransfer), mathematische Trennung spektral überlappender Floreszenzsignale, ... damit sehr gut möglich sind. Zudem nutzen wir in manchen Fällen die Möglichkeit des Aufzeichnens kompletter Anregungsspektren.

Diese Systeme sind schnell im Umschalten, hinken aber in der Lichtintensität meilenweit hinter den aktuelleren LED- bzw. remote Phosphor- oder Laser-gestützten Lichtquellen hinterher. Wenn man ein System mit verstellbarem Spalt hat, kann man auf Kosten der spektralen Definition etwas mehr Power herausholen, aber für Videos mit einer Consumer-Kamera müssten die Proben schon hervorragend hell gefärbt sein. Für Doppelanregungen mit zwei Wellenlängen waren sie zumindest im Standard-Aufbau nicht vorgesehen.

Werner schreibt zu recht, dass es auf die Spiegelgröße - genauer die NA - des Monochromators und der Einkopplung in diesen ankommt, wie viel Licht an dessen Austrittsspalt ankommt. Das ist natürlich korrekt und mag bei den Polychromen nicht maximal ausgenutzt worden sein, auch wenn die Czerny-Turner-Optik der Geräte beileibe nicht miniaturisiert ist. Ein Leistungsverlust dürfte bei den TILL Photonics-Geräten dadurch begründet sein, dass nicht die gesamte Höhe des am Ausstritt ankommenden "Regenbogenstreifen" genutzt wird, sondern nur der Anteil, der in den bei diesen Geräten recht dünnen Lichtleiter fällt. Berechnet waren die Lichtleiterdurchmesser und die NA der Einkopplung für die Ausleuchtung des Sehfeld-Anteils einer 40x/1.3-Optik, welcher durch die 2/3"-interline-CCD-Kameras (TILL Imago = PCO Sensicam) aufgezeichnet wird.

In der praktischen Nutzung haben wir, um mit dem Monochromator auch Anregungswellenlängen von 20-30 nm unter der Öffnung des Emissionsfilters noch ausnutzen zu können, trotzdem zusätzlich noch ein Kurzpass-Anregungsfilter (z.B. 500 nm short pass) eingebracht, damit der Hintergrund auch wirklich schwarz bleibt.

[Spectrum]

Hallo,
Auf deine Expertiese lieber Michael, hab ich gewartet. Das ist das tolle hier in diesem Forum!
Geballtes Fachwissen und gegenseitige Hilfe, super.
Dann weiß ich ja jetzt wo da der Haken ist.
Trotzdem sehr interessanter Ansatz.
Vielen Dank Werner und Michael.

[Spectrum]

Bei der Gelegenheit hätte ich natürlich auch gleich erneut die nächste Frage zum Thema Effizienz von LED's.
Wie sieht es da in den Bereichen außerhalb des sichtbaren Spektrums aus?
Zum einen im Bereich von 250-400nm und dann auch bei 950nm.
Sind da die klassischen Lichtquellen im Vergleich doch noch unter gewissen Vorraussetzungen im Vorteil (Stichwort Hg-Linie z.b.)?
Grüße Holger