Spirogyra Fluoreszenz

[anne]

Hallo Fluoreszenzspezialisten,
eine kurze Frage, wird bei Spirogyra der Zellkern von Acridinorange gefärbt?
lG
Anne

[Aljoscha]

Hallo Anne,

bei ausreichender Einwirkdauer bestimmt. Allerdings hast Du mit der Autofluoreszenz des Chlorophylls zu kämpfen. Es empfiehlt sich ein Filtersatz, der diese unterdrückt.

Viele Grüße

Alexander

[Daniel Scheibenstock]

Hi Zusammen,

Alex du kennst dich ja recht gut aus: Wäre es nicht Sinnvoller etwas zu nehmen das im Spektrum weiter weg ist als AO, ich denke an Dapi oder etwas anderes das mit UV angeregt wird?

liebe Grüße

Daniel

[Aljoscha]

Hallo Daniel,

DAPI geht da nicht. Es geht extrem schlecht durch die Zellwände lebender Zellen und eignet sich eher für fixiertes Material. Mit einem geeigneteren Farbstoff wie Hoechst 33342 dürfte es aber funktionieren. Das war allerdings nicht die Frage.

Viele Grüße

Alexander

[3nzo]

Hallo an die Teilnehmer dieser Diskussion.
Da bei Spirogyra-Filamenten die äußere Schicht aus Pektin und die innere Schicht aus Zellulose besteht. Darüber hinaus befindet sich auf der Außenseite der Zellwand eine schleimige Hülle, die sie meiner Meinung nach schleimig macht und das Eindringen des Farbstoffs behindert.  Ich nutze diese Gelegenheit, um Ihre Experten um Rat zum Verfahren zur Färbung des Zellkerns und der ihn unterstützenden Zytoplasmafilamente zu bitten, um sie hervorzuheben.
Vielen Dank und viele Grüße.

Enzo

[Aljoscha]

Hallo,

Ja, Spirogyra ist ein schwerer Fall. Kernfärbung klappt, wenn überhaupt, nur mit sehr langer Einwirkdauer. 72 -96 Stunden darf man schon ansetzen.

Viele Grüße

Alexander

[3nzo]

Hallo Alexander,
Kennen Sie ein Verfahren zur Unterscheidung von Kern und Zytoplasma in der Spirogyra? Halten Sie es 72 Stunden lang in den Farbstoff eingetaucht, um die innere Struktur aufgrund des Todes der Pflanze zu verändern.
Vielen Dank für jeden Rat und die besten Grüße.

Enzo

[Aljoscha]

Hallo Enzo,

Der Farbstoff muss so gering dosiert dem Aufbewahrungsgefäß zugegeben werden, dass er nicht toxisch wirkt. Die Zellen nehmen ihn im Lauf einiger Tage auf.

Acridinorange wirkt stark zelltoxisch und muss entsprechend gering dosiert werden, wenn die Alge überleben soll.

Meine Empfehlung wäre Hoechst 33342, um die Zellkerne zu färben. Es wirkt nicht so toxisch.

Viele Grüße

Alexander

[Apochromat]

Hallo Anne,

wenn Du den Zellkern gemeinsam mit dem roten Chlorophyll darstellen willst, nimmst Du zur Kernfärbung DAPI (einfach in VOLVIC auflösen). Die Endkonzentration von DAPI sollte etwa 0,1 µg/ ml betragen. Nach etwa 10 Minuten kann man dann schon einmal testen, ob der/ die Zellkerne schon angefärbt sind.


Die Stammlösung setzt man in folgender Konzentration an: 5mg/ ml. Diese kann man gut in EPPENDORF- Caps einfrieren und die ist jahrzehntelang haltbar.

DAPI kann wunderbar auch zur Kernfärbung von Desmidiaceen, Fadenalgen und allen anderen Zellwandbehafteten Protisten eingesetzt werden.

Ich verwende es noch manchmal zum Anfärben des Kinetoplasten bei den Bodoniden. Da man dieses sehr große Mitochondrium (dessen Lage in den kleinen Flagellatenzellen durch Mikrotubuli- Bänder festgelegt ist) aber sehr gut auch im Phasenkontrast oder DIK sieht, mache ich das nur noch selten.

Als Filtersatz nimmst Du z.B. einen Filtersatz mit UV- Anregung und Langpass- Emmissionsfilter (z.B. ZEISS- Filtersatz #02 o.ä.). Regt man DAPI- gefärbte Objekte mit Blau- statt UV- Licht an, erhält man ein schmutzig- grünlich- gelbes Fluoreszenzsignal.

Ein früher sehr populäres Mikroskopie- Buch hatte so ein Motiv auf der Buchtitelseite des Umschlages:




LG

Michael

[3nzo]

Hallo,
Dieses Forum bietet immer interessante Anregungen.

@Alexander
Kann das Verfahren auch mit Toluidinblau angewendet werden?

@Michael
Warum muss dem UV-Anregungsfilter zusätzlich ein Langpass-Emissionsfilter hinzugefügt werden? Funktioniert dieser Filter auch bei der Anregung mit blauem Licht?

@Anne
Es tut mir leid, wenn ich mich an der Diskussion beteiligt habe, ich werde hier enden.

Vielen Dank und viele Grüße an alle.

Enzo

[Aljoscha]

Kann das Verfahren auch mit Toluidinblau angewendet werden?

Toluidinblau habe ich nie verwendet und kann nichts dazu sagen.

Warum muss dem UV-Anregungsfilter zusätzlich ein Langpass-Emissionsfilter hinzugefügt werden?

Weil dir sonst das UV-Licht die Augen wegbrennt.

Viele Grüße

Alexander

[Apochromat]

@Michael
Warum muss dem UV-Anregungsfilter zusätzlich ein Langpass-Emissionsfilter hinzugefügt werden? Funktioniert dieser Filter auch bei der Anregung mit blauem Licht?

Hallo Enzo,
nein dieser Fluoreszenzfiltersatz #02 enthält ein UV- Anregungsfilter, Farbteiler und Sperrfilter. Der Emissions- oder Sperrfilter ist ein Langpassfilter, der alles Licht ab etwa 420 nm durchläßt, also auch die blauen und roten Fluoreszenzsignale gemeinsam sichtbar werden läßt. Der Zellkern und die Chlorplasten werden jeweils vom UV- Licht angeregt.

PS: Dieser UV- Filtersatz mit Langpass-Sperrfilter war früher bei allen Geräten Standard. Heute benutzt man solche UV- Langpassfiltersätze nur noch in der Forensik, für Autofluoreszenzuntersuchungen und in der Baustoffmikroskopie/ Mineralogie.

LG
Michael

[anne]

Lieber Michael,
ich danke Dir für Deine fachkundigen Ratschläge, wie immer perfekt! Dapi habe ich, nun muss ich mal meine Filterwürfel genauer anschauen.

Enzo: es ist kein Problem, dass Du hier Deine Fragen stellst, alle Anregungen und Fragen sind willkommen.

Alexander, Danke für Deine Tips, das hilft mir viel weiter.

Danke an alle
Anne

[3nzo]

Vielen Dank euch allen.

Enzo