Präparationsvorgänge

[Detlef Kramer]

Hallo,

die geht auch perfekt!

Detlef

[Armin Z.]

Mir ist noch eine Frage aufgekommen.

Hier erst mal meine bisherigen Präparationsschriette (die Dauer ist bei einigen Schritten zu groß):

Präparat von einer Weißtanne, Kiefer, Mistel.

-Fixierung in AFE Gemisch ca. 26h
-kurz mit Wasser ausgewaschen
-in Isopropylalkohol 50% für 9h entwässert
-70% Isoprop. für ca. 10h
-100% Isoprop für 9h 48m
- nun wird das 1:1 Gemisch aus Isoprop. u. Paraffin gerade bei 60°C erhitzt

Als Anleitung habe ich die beiden Pdf Dokumente (Berliner.. und das Dokument von Jörg) verwendet. Nun habe ich das Problem, dass in dem Pdf von Jörg keine Anleitung für Paraffinschnitte enthalten ist. In dem "Einführungskurs in die Mikroskopie für Einsteiger" ist die Erstellung von Paraffinschnitten beschrieben. Doch leider verwenden sie, um das Paraffin aus dem Schnitt wieder zu lösen Xylol. Auf diese Reagenz würde ich gerne verzichten. Gäbe es für das starke Lösungsmittel Xylol "ungiftigere" Alternativen? Muss ich die Präparate wirklich 20h lang bei 60°C halten? Gibt es noch schnellere Möglichkeiten? Wie funktioniert die Einbettung mit Glycerinseife anstatt dem Paraffin? Ist die Seife besser geeignet?

Tut mir wirklich leid für meine andauernden Fragen - doch leider konnte ich bis jetzt (auch nach Suche) keine Antworten finden. Ich habe in diesem Forum einen in Gycerinseife eingebetteten Histologieschnitt gesehen, allerdings konnte ich diesen Thread nicht mehr finden.

Mfg ARmin  

[Detlef Kramer]

Hallo Armin,

der Beotrag über die Glycerinseife-Einbettung ist http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4640.0hier verewigt worden.

Davon abgesehen, finde Ich Deine Vorgehensweise etwas blauäugig. Ich meine, mann müsste sich doch erst einmal einen genauen Plan über den Ablauf der gesamten Geschichte machen und die offenen Fragen abklären, bevor man beginnt. OK, im Paraffin kannst Du die Sachen lassen, dort halten sie mindestens Jahrzehnte. Dass allerdings P. bei 60 °C schmilzt, kann niemand ändern.

Als Lösungsmittel zum Entparaffinieren gibt es in der Tat Alternativen; z.B. RothiHistol auf der Basis von Orangenschalenöl. Leider liefert Roth nicht an privat. aber vielleicht kann ja jemand helfen. In Baumärkten gibt es Lösungsmittelgemische als Pinselreiniger und Lackverdünner für Ölfarben u.ä,, nicht Nitrolacke. Ich habe so etwas noch nicht ausprobiert, könnte mir aber vorstellen, dass es geht. DEN Gestank möchte ich allerdings auch nicht in der Wohnung haben.

Glycerinseife ist möglicherweise für viele Fragestellungen eine sehr brauchbare, umweltfreundliche Alternative.

Also, dann lass uns einmal warten, wie es weiter geht und ob wir dir auch erklären dürfen, wie man ein Mikrotom beschafft, Messer abzieht usw. Steht übrigens, so ganz nebenbei, alles in der Mikrofibel. Und ich bin der Meinung, so etwas macht man am Besten an der Seite eines erfahrenen Freundes.

Herzliche Grüße

Detlef Kramer

[moniaqua]

Als Lösungsmittel zum Entparaffinieren gibt es in der Tat Alternativen; z.B. RothiHistol auf der Basis von Orangenschalenöl.

Wenn das geht, wäre evtl. Oranex  oder ähnliche Orangenreiniger einen Versuch wert. Wenn es dazu nicht taugt, kann man damit immer noch putzen und es stinkt nicht so

[treinisch]

Als Lösungsmittel zum Entparaffinieren gibt es in der Tat Alternativen; z.B. RothiHistol auf der Basis von Orangenschalenöl.

Hallo,

geht nicht auch irgendeine der naheliegenden harmlosen Alternativen Heptan oder Hexanol oder sowas?
Lampenöl löst doch bestimmt auch Paraffin auf, oder?

Und dann bleibt ja noch die Mischung aus Antimonfluorid und Fluorsulfonsäure zum Entparaffinieren

Liebe Grüße

Timm

[Detlef Kramer]

Hallo,

Oranex könnte eine Alternative sein. Es hat nur möglicherweise den Nachteil, dass es Fette enthält. Das müsste man probieren.

Anders: muss es denn wirklich gleich der Hammer Paraffinschnitt sein? Und wenn schon, ist ja faszinierend, geht das nicht erst einmal mit jemand, der auf dem Gebiet Erfahrung hat?

Ich sehe gerade, dass Du in Passau wohnst. Hallo Passauer Schnippler, meldet Euch! Mal sehen, ob der Appell hilft. Ansonsten werden wir Dir auch weiterhin helfen.

Herzliche Grüße

Detlef

[Holger Adelmann]

Ich denke man kann als Intermedium fuer's Paraffin auch Terpineol (Schreibweise beachten, ich meine NICHT Terpentinoel) nehmen, wenn das Xylol zu bedenklich bzw. geruchsintensiv erscheint.

Herzliche Gruesse
Holger

[Armin Z.]

Hallo zusammen!

ich melde mich wieder einmal. Ich bin noch nicht so weit die chem. Zusammenhänge z.B. während der Fixierung zu verstehen. Wie wird das Gewebe in der AFE Lösung denn gehärtet? Es ist ja letztendlich ein Ester, der in der AFE Lösung, vorliegt. Und wie kann der Ester das Gewebe härten? Entzieht er diesem das Wasser und lässt es sozusagen etwas trocknen? Für die Entwässerung sind doch normalerweise die Alkoholstufen zuständig. Für das "Rauslösen" des Paraffins am Ende wird ja Xylol oder ein anderer "Grundaromat" wie Benzol verwendet. Ich habe bedenken ohne Abzug mit solchen gefährlichen Chemikalien zu arbeiten. Daher versuchte ich mir Rat bei einem Chemiker einzuholen, der meinte dass n-Hexan-Oktan, bzw. Cyclohexan auch an die Eigenschaften des Xylols annähernd herankomme. Ich habe dies noch nicht probiert, da ich noch keinen guten Schnitt hatte. 
Ich hab vor kurzem ein gebrauchtes Rotationsmikrotom erstanden und hatte schon Präparate, die in Paraffin eingebettet waren (nach Anleitung "Von der Probe zum Präparat"). Ich habe sie dann nach vergeblichen versuchen mit meinem Handzylindermikrotom wieder in dem Paraffin erstarren lassen. Diese Präparate sind leider, nach dem Rotationsmikrotomschnitt (mit passendem Arbeitswinkel ca. 10°) während der Streckung auf ca. 45°C heißem Wasser (erstmals, da noch nichts anderes zur Hand war) zerfallen. Somit waren diese nicht brauchbar. Nun die eigentliche Frage: An was könnte dieses Zerfallen liegen? Die Probe, ein Mistelblattquerschnitt, war in ca. 1cm große Stücke zerteilt worden und in AFE fixiert (für 2 Tage), nach einem kurzem Auswaschen in die Alkoholstufen (inwiefern spielt hier die Zeitdauer eine Rolle?) überführt. Dann wurden die Präparate einen Tag lang in einem 1:1 Gemisch aus Isopropylalkohol und Paraffin auf 60°-70° gehalten. Leider habe ich noch kein Wasserbad, bzw. eine stufenlos regelbare Einheit zur Verfügung, so musste ich auf die Herdplatte mit einem wassergefüllten Topf zurückgreifen. Daher ist die Temperatur nach verdampfen des Wassers für ca. 2h auf 120°C angestiegen. Könnte der Temperaturanstieg das Problem sein?

Ich weiß, dies sind viele Fragen und die eine oder andere ist vll. im Netz beantwortbar. Doch es wäre nett, wenn ihr mir die meisten beantworten könntet. Leider habe fand ich bis jetzt keinen in Passau der Mikrotomschnitte macht. Auch auf der Mitgleidermap dieses Forums ist keine Nadel für Passau auffindbar.

Mfg Armin

PS: Ich bin dabei mich durch dieverse PDF-Dokumente zu kämpfen. Bloß hasse ich das Computerlesen von paar hunderten Seiten. Somit schaffe ich es nur Etappenweise. Aber ich will mir demnächst die Dokumente ausdrucken lassen. Dann hoffe ich, dass ich keine dummen Fragen mehr stelle.

[Klaus Henkel]

Alkohol z.B. härtet gut. Xylol ganz schlimm: "Sie werden nicht selten so spröde und hart, daß sie kaum oder überhaupt nicht schneidbar sind. Xylol und Toluol wirken bei den meisten botanischen Objekten verheerend! ..." (Dr. Dieter Krauter)

Leider habe fand ich bis jetzt keinen in Passau der Mikrotomschnitte macht. Auch auf der Mitgleidermap dieses Forums ist keine Nadel für Passau auffindbar.

Worüber würden Sie denn mit einem anderen Mikroskopiker reden wollen? Dazu müssen Sie doch erst einmal eine gewisse Ahnung haben, sonst ist ein Gespräch doch unfruchtbar.

Ich bin noch nicht so weit die chem. Zusammenhänge z.B. während der Fixierung zu verstehen. Wie wird das Gewebe in der AFE Lösung denn gehärtet? Es ist ja letztendlich ein Ester, der in der AFE Lösung, vorliegt. Und wie kann der Ester das Gewebe härten? Entzieht er diesem das Wasser und lässt es sozusagen etwas trocknen? Für die Entwässerung sind doch normalerweise die Alkoholstufen zuständig. Für das "Rauslösen" des Paraffins am Ende wird ja Xylol oder ein anderer "Grundaromat" wie Benzol verwendet. Ich habe bedenken ohne Abzug mit solchen gefährlichen Chemikalien zu arbeiten. Daher versuchte ich mir Rat bei einem Chemiker einzuholen, der meinte dass n-Hexan-Oktan, bzw. Cyclohexan auch an die Eigenschaften des Xylols annähernd herankomme.

Was wollen Sie eigentlich? So langsam gewinne ich den Eindruck, daß Sie mehr über Chemie fachsimpeln wollen.
Doch wenn Sie gute Paraffinschnitte machen möchten, hier ein gutgemeinter Rat: Hören Sie auf mit dem Chemiegedöns. Halten Sie sich an Rezepte, die sich seit mehr als 100 Jahren bewährt haben. Erst wenn Sie die alle aus dem ff beherrschen, ist es Zeit über Cyclohexan etc pp nachzudenken.

Ich habe dies noch nicht probiert, da ich noch keinen guten Schnitt hatte.

Lernen Sie erst einmal gute Handschnitte machen, bevor Sie sich an Mikrotomschnitte wagen!

Kaufen Sie sich Gerlachs Botanische Mikrotechnik oder den Romeis, 16. Aufl. Und lesen Sie, lesen Sie viel, bevor Sie Chemikalen kaufen. Die Mikroskopie ist eine angewandte Wissenschaft für Leute, die gerne lesend lernen. Und halten Sei sich buchstabengetreu an die in der Fachliteratur beschriebenen Rezepte!

Lesen: Auf der Homepage der MVM: Die beiden verlinkten Aufsätze unter NEU igkeiten im menu oben rechts: http://www.mikroskopie-muenchen.de/

KH

[Jürg Braun]

Guten Tag Herr Henkel

Wo kriege ich die zwei genannten Bücher denn zu kaufen? Bei Amazon sind beide vergriffen.

freundlicher Gruss

Jürg Braun

[Klaus Henkel]

Wo kriege ich die zwei genannten Bücher denn zu kaufen? Bei Amazon sind beide vergriffen.
Jürg Braun

Hallo Herr Braun! Suchen Sie ein Antiquariat auf. Wenn keines in der Nähe ist, dann versuchen Sie es über diese Links:

http://www.zvab.com
http://www.findmybook.de/
http://www.bresinsky.de/index.htm

Es gibt zahllose weitere!

Amazon kann das auch, ist aber viel zu tüdelig, unbeholfen.

Wenn Sie an Ihrem Wohnort einen Antiquar mit Internetanschluß haben, dann sagen Sie dem, er soll Ihnen das besorgen. Das kostet oft überraschend wenig.
Gruß KH

[RainerTeubner]

Hallo Armin,

in dem AFE-Gemisch liegt kein Ester vor, sondern ein Gemisch aus Alkohol, Essigsäure und Formaldehyd. Es ist nicht so, daß die beiden Verbindungen (Alkohol und Säure) spontan unter Wasseraustritt zu dem Ester reagieren. Die Esterbildung erfordert, um ausreichend schnell und mit befriedigender Ausbeute abzulaufen, die Verwendung eines Katalysators, erhöhter Temperatur und die Abtrennung des gebildeten Wassers aus dem Reaktionsgemisch. Der Essigsäureethylester im AFE-Gemisch dürfte allensfalls in zu vernachlässigenden Mengen (für unsere Zwecke) vorliegen.

Der Anstieg der Temperatur auf 120 Grad Celsius während der Paraffin-Prozedur dürfte meiner Meinung nach Deine Probe zerstört haben.

Mit freundlichen Grüßen

Rainer

[Peter V.]

Hallo Herr Teubner,

es wäre sicher sehr vermessen von mir, einem Chemiker widersprechen zu wollen, aber ich möchte noch einmal nachhaken: Was ich in meiner Flasche mit AFE rieche, ist weder A, noch, F, noch E, sondern ausschließlich der typisch fruchtige Estergeruch von Essigsäureethylester.
Ob Selbiger neben dem sicher im Gemisch auch noch vorhandenen Alkohol und der Essigsäure einen Effekt auf das Gewebe hat, weiss ich nicht. Aber mit meiner olfaktorischen Vermutung, dass Essigsäureethylester zumindest in nicht ganz unerheblicher Konzentration vorliegt, kann ich doch nicht so falsch liegen - oder doch

Herzliche Grüße
Peter

[treinisch]

es wäre sicher sehr vrmessen von mir, einem Chemiker widersprechen zu wollen, aber ich möchte noch einmal nachhaken: Was ich in meiner Flasche mit AFE rieche, ist weder A, noch, F, noch E, sondern ausschließlich der typisch fruchtige Estergeruch von Essigsäureethylester.
Ob Selbiger neben dem sicher im Gemisch auch noch vorhandenen Alkohol und der Essigsäure einen Effekt auf das Gewebe hat, weiss ich nicht. Aber mit meiner olfaktorischen Vermutung, dass Essigsäureethylester zumindest in nicht ganz unerheblicher Konzentration vorliegt, kann ich doch nicht so faslsch liegen - oder doch

Hallo Peter,

ich sehe nichts, was gegen eine absolut nennenswerte Konzentration von Essigester spricht, außer vielleicht die Zeit.
Nimmt man eine GG-Konstante für die Bildung von ~10 an, was, soweit ich mich erinnere in etwa stimmen dürfte,
würde für die Rezeptur nach http://www.aeisner.de/rezepte/fixant2.html im Gleichgewicht eine
Essigester-Konzentration von fast 0.8 mol/l folgen. Auch ohne Katalysator wird sich also im Laufe von Wochen eine
nennenswerte Essigester-Konzentration bilden. Vor allem, wenn man sie in Relation zur Essigsäure-Konzentration setzt.

Herzliche Grüße
Timm Reinisch

[RainerTeubner]

Hallo Peter, hallo Timm,

ich hab grad eben AFE-Lösung frisch angesetzt und daran gerochen. Der stechende Geruch nach Formaldehyd überdeckt alles. Wie alte Lösung riecht, werde ich in 4 Wochen berichten. Man sollte es mal genau ausrechnen, den exakten Wert für die Gleichgewichtskonstante der Essigsäureethylester-Bildung muß ich mir noch besorgen.

Viele Grüße

Rainer