Standardpräparate Kontrastverfahren

[Lupus]

Hallo,

ich habe mir erlaubt, aus dem 4. PDF-Dokument von Jürgen wo es um die "Tiefenschärfe" von Phasenkontrastverfahren geht, Bilder mit DIK, schiefer Beleuchtung und ringförmiger Beleuchtung zum Vergleich nebeneinander zu stellen. Phasenkontrast nach Zernike passt hier systembedingt nicht dazu, da es eigentlich nur für dünne Phasenobjekte gut funktioniert.

Ich habe die Bildhelligkeiten (speziell die RFB) zum besseren Vergleich noch auf ein ähnliches Niveau gebracht (nicht durch Kontrastveränderung sondern Verschiebung der mittleren Pixelhelligkeit).
Man sieht dass DIK hier einen etwas höheren Kontrast erzeugt als schiefe Beleuchtung. Allerdings hängt das auch von der Fokuslage ab, die nicht absolut identisch ist (es ist tatsächlich sehr schwierig, die exakt gleiche Fokuslage zu erreichen geht nach meiner Erfahrung nur durch eine Fotoserie).
Außerdem gibt es Unterschiede zwischen verschiedenen DIK-Systemen (Thema Auflösung-Kontrast), siehe Vergleich von Martin Kreutz 
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=37743.msg277519;topicseen#msg277519
Und auch bei der schiefen Beleuchtung hängt der Kontrast sehr empfindlich von der Blendenkonstellation ab.

Tendenziell scheint DIK wie Jürgen schon erwähnt hat zusätzlich eine erkennbar bessere Trennung der Höhenschichten zu ermöglichen (geringere Tiefenschärfe mit geringerer Beeinflussung benachbarter Phasenobjekte). Das kann ein Vorteil sein, aber je nach Anwendung auch ein Nachteil. Auf jeden Fall grenzt sich die schiefe Beleuchtung mit optimaler Blende hier deutlich von anderen Kontrastverfahren-Varianten mit modifizierten Blenden ab, insbesondere von den konzentrischen Blendenformen wie ringförmige Beleuchtung, Dunkelfeld oder abgeblendete Kondensorapertur.
In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels und dadurch der stark erhöhte Einfluss der Interferenz durch Objektschichten außerhalb der Brennebene bzw. der normalen Tiefenschärfe. Das sieht man beim Beispiel ringförmiger Beleuchtung, aber noch stärker beim Dunkelfeld (was ja nichts anderes als eine ausgeprägte ringförmige Beleuchtung ist).
 
Schiefe Beleuchtung mit nur einseitig halbierter Ausleuchtung der Objektiv-NA hat dagegen eine nahezu optimal geringe Kohärenz der Beleuchtung, nur etwas schlechter als DIK. Wenn man die Bilder heraus zoomt und kleinste Details vergleicht (bei allen Problemen der Fokuslage) kann man sogar den Eindruck bekommen, dass die Objektauflösung der schiefen Beleuchtung minimal höher ist als DIK. Dagegen fällt die oft für diesen Zweck so gelobte ringförmige Beleuchtung bei der Auflösung drastisch ab.



Hubert

[purkinje]

Hallo Jürgen,
auch Dein 4.Teil ist sehr interessant geworden.
Die "Spiegelei-Kombi" aus kleiner Glaskugel und darunterliegendem flächigem Glassplitter zeigt die Ähnlichkeiten und Unterschiede bei den beiden Fokuslagen sehr gut.
Zur RFB habe ich irgendwie noch im Kopf, dass Du den Heine Kondensor verwendet hast, wenn ich nicht irre?
Wo lag denn der Lichtring/Innenradius ungefähr?
Beste Grüße Stefan

[Jürgen Boschert]

Hallo Stefan,

danke für den Kommentar.

Zur RFB: Verwendet habe ich als Objektiv den Zeiss-West Planapo 25/9,65 Ph2. Ich habe zwar den Heine versucht, aber der harmoniert irgendwie nicht richtig mit dem Objektiv. Daher habe ich die RFB mit der Phasenblende 3 am Revolverkondensor erzeugt.



Hallo Hubert,

auch Dir herzlichen Dank!
Das mit der einheitlichen Fokuslage ist wirklich schwierig, auch zumal sich sogar beim Wechseln der Kontrastmethode sich die korrekte Fokussierung leicht ändert, besonders ausgeprägt beim Wechsel von Hellfeld zum Phasenkontrast.

[rlu]

Hallo,


Der Artikel ist lesenswert.
(Thema Auflösung-Kontrast), siehe Vergleich von Martin Kreutz
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=37743.msg277519;topicseen#msg277519

Dabei gibt es jedoch ein Problem! Je geringer die Aufspaltung der Teilstrahlen ist(High Resolution DIC), umso geringer ist auch der Kontrast.

Wir betrachten es mit einem PlanApo 100X/1,4 Objektiv. Man darf erwarten, dass dieses Objektiv alle Strukturen in diesem Präparat auflöst, aber wir erkennen sie kaum, weil es ein reines Phasenobjekt ist.

A. Woran liegt es eigentlich, dass DIC eine geringere Tiefenschärfe hat?

u.a " Wie ich schnell gemerkt habe, eignet sich DIK-HR besonders gut für das fotografieren von vergleichsweise dicken Objekten mit vielen hochbrechenden Anteilen. Ein typisches Beispiel für diese Art von Objekten sind Rädertiere"

B. Kohärenz ist Voraussetzung für Interferenz, weil dann bei zwei Wellen die Frequenz und die räumliche Lage übereinstimmen. Die Phase kann unterschiedlich sein. Dann erfolgt Interferenz von Auslöschung bis Verstärkung.
Die Kohärenzlänge scheint sehr kurz zu sein, wenn es sich nicht um Laserlicht oder Licht von fremden Sternen handelt.

" In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels"

Was ist damit gemeint?
Ich bin mir auch noch nicht sicher, ob ich das mit der Kohärenz verstanden haben.

C. Man sagt ja, bei der schiefen Beleuchtung kommen mehr Maxima ins Objektiv, weil der Strahlengang aus dem Zentrum verschoben wurde. Das ergibt eine seitige Erhöhung der Auflösung. Warum funktioniert die schiefe Beleuchtung bei Phasenobjekten überhaupt. Wie soll es etwas schärfer werden, wenn es keinen Kontrast hat.
Kann die schiefe Beleuchtung dann doch Phasenobjekte auflösen ?

Liebe Grüße
Rudolf

[Lupus]

Hallo Rudolf,

über Deine Fragen könnte man viele Seiten schreiben.

Woran liegt es eigentlich, dass DIC eine geringere Tiefenschärfe hat?

Die geringe Tiefenschärfe von DIK kommt von der besonderen Methode der Kontrasterzeugung. Dabei werden zwei gleichen "Bilder", nur minimal gegeneinander versetzt (eigentlich das gleiche Objekt, nur optisch verschoben), überlagert. Der Bild-Helligkeitsverlauf entsteht also ausschließlich durch die Veränderung der örtlichen Phasenverschiebung innerhalb des geometrischen Bildversatzes. Die Interferenz von phasenverschobenen Wellen wird im normalen Hellfeld durch die hohe Intensität des homogenen Bildhintergrundes gestört, dieser ist aber bei den beiden verschobenen Bildern im DIK jeweils gleich und beeinflusst die relative Phasenänderung nicht.

Objekte außerhalb der Brennebene (oder genauer außerhalb der normalen Tiefenschärfe des Objektivs), die innerhalb des breiten Beleuchtungskegels oberhalb und unterhalb der Fokusebene liegen und damit ebenfalls in die Bildentstehung einfließen, beeinflussen aber beide versetzten Bilder (nahezu) auf die gleiche Weise. Denn die oben beschriebene geringe optische Bildversetzung ist sehr klein gegenüber der Breite des für beide Bilder gemeinsamen Beleuchtungskegels. D.h. dass diese Phasenverschiebungen für Objekte außerhalb der Brennebene (und innerhalb des für die Bildentstehung relevanten Beleuchtungskegels liegen) ebenfalls bei der Differenzbildung der beiden Bilder im DIK-Verfahren herausgemittelt werden und somit nicht als kontrastreiches Objekt erscheinen können.

Die Kohärenzlänge scheint sehr kurz zu sein, wenn es sich nicht um Laserlicht oder Licht von fremden Sternen handelt.

" In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels"

Was ist damit gemeint?

Das komplexe Thema ganz verkürzt:
 
Es geht hier nicht um die zeitliche Kohärenz (als spektral engbandiges Licht), sondern um die räumliche Kohärenz. Die kann auch durch eine ausreichend kleine Lichtquelle erzeugt werden, solange der Ausbreitungswinkel zweier interferierender Wellen klein genug bleibt. Bei Kondensorbeleuchtung erzeugt jeder "Punkt" der Leuchtfläche in der vorderen Brennebene des Kondensors eine parallele Wellenfront. Die Lage des Punktes zur optischen Achse verändert lediglich den Winkel der Wellenfront zur Achse.

Eine einzelne solche Welle erzeugt am Objekt eine dazu kohärente gestreute Welle, beide interferieren im Bild nach dem Objektiv wieder miteinander und erzeugen eine Helligkeitsverteilung. Der Bildkontrast ist sehr gering (normales Hellfeld) wenn die Objektphasenverschiebung nicht sehr groß ist, weil die Hintergrundwelle (Beugung 0. Ordnung) in seiner Intensität dominiert und die gebeugte Welle 90° phasenverschoben ist. Ein schwaches Phasenobjekt außerhalb des Fokus wird interessanterweise kontrastreicher abgebildet, weil die Defokussierung zu einer zusätzlichen Phasenverschiebung führt und die Intensität, also den Objektkontrast, steigert (das kann jeder aufmerksame Mikroskopiker bei dünnen Objekten beobachten). Daher wird bei hochgradig kohärenter Beleuchtung auch jedes Staubkörnchen deutlich außerhalb der Fokusebene kontrastreicht als Störung abgebildet.

Jeder weitere "Punkt" der betrachteten Leuchtfläche vor dem Kondensor erzeugt ein ähnliches Interferenzbild, das durch den unterschiedlichen Welleneinfallswinkel aber in der Interferenzstruktur abweicht. Diese "Leuchtpunkte" sind jedoch nicht kohärent, haben keine feste Phasenbeziehung zueinander. D.h. alle diese Interferenzbilder in der Bildebene interferieren nicht konstruktiv mit ihrer Wellenamplitude, sondern addieren sich lediglich mit ihrer Intensität. Es entsteht eine Mittelung der Interferenzbilder der verschiedenen Beleuchtungswinkel, die starke Kohärenzwirkung der Einzelwelle wird zunehmend abgeschwächt. Wenn man den maximalen Beleuchtungswinkel verwendet (NA_Kondensor = NA_Objektiv) ist die gesamte Bildentstehung inkohärent und der Bildkontrast von Phasenobjekten am geringsten. Speziell die zusätzliche Phasenverschiebung von Objekten außerhalb der Fokusebene wird herausgemittelt und diese dadurch weniger sichtbar.

Daraus folgt, dass eine Beleuchtung mit teilweise reduziertem Beleuchtungswinkel wie z.B. ein zentral abgeblendeter Kondensor oder eine ringförmige Beleuchtung bezüglich der Interferenzeffekte bei der Bildentstehung zumindest teilweise kohärent sind im Vergleich zu einem voll aufgeblendeten Kondensor. Und damit entsteht auch die kontrastreichere Abbildung von außerhalb der Brennebene liegenden Phasenobjekten.

Beim Phasenkontrastverfahren nach Zernike hat man durch die ringförmige Blende ebenfalls eine erhöhte Kohärenz bei der Abbildung und auch die bekannte geringe Selektivität der Phasendarstellung in der Objekttiefe. Der erhöhte Bildkontrast gegenüber normalem Hellfeld entsteht durch die Abschwächung der im Normalfall zu intensiven 0. Beugungsordung mit Hilfe der Phasenblende sowie dessen Phasenverschiebung um etwa ±90° (je nach System).

Man sagt ja, bei der schiefen Beleuchtung kommen mehr Maxima ins Objektiv, weil der Strahlengang aus dem Zentrum verschoben wurde. Das ergibt eine seitige Erhöhung der Auflösung. Warum funktioniert die schiefe Beleuchtung bei Phasenobjekten überhaupt. Wie soll es etwas schärfer werden, wenn es keinen Kontrast hat.
Kann die schiefe Beleuchtung dann doch Phasenobjekte auflösen ?

Die letzte Frage ist doch etwas ungewöhnlich, denn hier geht es dauernd um Bildbeispiele von Phasenobjektien, auch genügend Vergleichsbilder zwischen DIK und schiefer Beleuchtung.
Ich spare mir jetzt Erläuterungen dazu, hier gibt es eine (sicher nicht einfach verständliche) mathematische Beschreibung der Funktion der schiefen Beleuchtung
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40948.msg301649;topicseen#msg301649

oder Du liest besser den ganzen Beitrag von Anfang an durch. Eine einfache bildhafte Beschreibung mit wenigen Sätzen, wie ich sie aus einigen Artikeln kenne, führt regelmäßig zu falschen physikalischen Begründungen.

Hubert

[rlu]

Hallo Hubert,
harter Stoff, ich bin noch am Grübeln. Auf jeden Fall vielen Dank für die Antwort.
Wird wohl noch Zeit brauchen bis ich da durchsteige.


Zitat: Woran liegt es eigentlich, dass DIC eine geringere Tiefenschärfe hat?
zwei gleiche "Bilder"werden nur minimal gegeneinander versetzt
--> 
das ist von Dir anschaulich dargestellt mit einem Bildbearbeitungsprogramm wo zwei Bilder auf zwei Ebenen verschoben werden.


Der Bild-Helligkeitsverlauf entsteht also ausschließlich durch die Veränderung der örtlichen Phasenverschiebung innerhalb des geometrischen Bildversatzes. Die Interferenz von phasenverschobenen Wellen wird im normalen Hellfeld durch die hohe Intensität des homogenen Bildhintergrundes gestört, dieser ist aber bei den beiden verschobenen Bildern im DIK jeweils gleich und beeinflusst die relative Phasenänderung nicht.

Objekte außerhalb der Brennebene (oder genauer außerhalb der normalen Tiefenschärfe des Objektivs), die innerhalb des breiten Beleuchtungskegels oberhalb und unterhalb der Fokusebene liegen und damit ebenfalls in die Bildentstehung einfließen, beeinflussen aber beide versetzten Bilder (nahezu) auf die gleiche Weise. Denn die oben beschriebene geringe optische Bildversetzung ist sehr klein gegenüber der Breite des für beide Bilder gemeinsamen Beleuchtungskegels. D.h. dass diese Phasenverschiebungen für Objekte außerhalb der Brennebene (und innerhalb des für die Bildentstehung relevanten Beleuchtungskegels liegen) ebenfalls bei der Differenzbildung der beiden Bilder im DIK-Verfahren herausgemittelt werden(Deshalb Differenzkontrast/Differential) und somit nicht als kontrastreiches Objekt erscheinen können.
--> 
Ich stelle mir das so wie bei einem Operationsverstärker vor, der als Instrumentenverstärker arbeitet.
Auch hier werden die gleichteiligen Anteile nicht verstärkt.

-->
Ich frage mich gerade, ob man die Trennung/Ablenkung auch ohne Prisma hinkriegen könnte. Und dann werden die beiden Bilder gegeneinander abgezogen. Die Differenz wird in einem Bildbearbeitungsprogramm gebildet.



Zitat: Die Kohärenzlänge scheint sehr kurz zu sein, wenn es sich nicht um Laserlicht oder Licht von fremden Sternen handelt.
Zitat" In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels"
Was ist damit gemeint?
Das komplexe Thema ganz verkürzt:
 
Es geht hier nicht um die zeitliche Kohärenz (als spektral engbandiges Licht), sondern um die räumliche Kohärenz. Die kann auch durch eine ausreichend kleine Lichtquelle erzeugt werden, solange der Ausbreitungswinkel zweier interferierender Wellen klein genug bleibt. Bei Kondensorbeleuchtung erzeugt jeder "Punkt" der Leuchtfläche in der vorderen Brennebene des Kondensors eine parallele Wellenfront. Die Lage des Punktes zur optischen Achse verändert lediglich den Winkel der Wellenfront zur Achse.

Eine einzelne solche Welle erzeugt am Objekt eine dazu kohärente gestreute Welle, beide interferieren im Bild nach dem Objektiv wieder miteinander und erzeugen eine Helligkeitsverteilung. Der Bildkontrast ist sehr gering (normales Hellfeld) wenn die Objektphasenverschiebung nicht sehr groß ist, weil die Hintergrundwelle (Beugung 0. Ordnung) in seiner Intensität dominiert und die gebeugte Welle 90° phasenverschoben ist.
--> 
wird wohl so sein. Da hakt es bei mir noch.

Ein schwaches Phasenobjekt außerhalb des Fokus wird interessanterweise kontrastreicher abgebildet, weil die Defokussierung zu einer zusätzlichen Phasenverschiebung führt und die Intensität, also den Objektkontrast, steigert (das kann jeder aufmerksame Mikroskopiker bei dünnen Objekten beobachten).
Daher wird bei hochgradig kohärenter Beleuchtung auch jedes Staubkörnchen deutlich außerhalb der Fokusebene kontrastreicht als Störung abgebildet.
--> 
ist mir bei Bakterien aufgefallen. Der Kontrast wird  stärker, wenn sie nicht im Fokus sind.

 

Jeder weitere "Punkt" der betrachteten Leuchtfläche vor dem Kondensor erzeugt ein ähnliches Interferenzbild, das durch den unterschiedlichen Welleneinfallswinkel aber in der Interferenzstruktur abweicht. Diese "Leuchtpunkte" sind jedoch nicht kohärent, haben keine feste Phasenbeziehung zueinander. D.h. alle diese Interferenzbilder in der Bildebene interferieren nicht konstruktiv mit ihrer Wellenamplitude, sondern addieren sich lediglich mit ihrer Intensität. Es entsteht eine Mittelung der Interferenzbilder der verschiedenen Beleuchtungswinkel, die starke Kohärenzwirkung der Einzelwelle wird zunehmend abgeschwächt. Wenn man den maximalen Beleuchtungswinkel verwendet (NAKondensor = NAObjektiv) ist die gesamte Bildentstehung inkohärent und der Bildkontrast von Phasenobjekten am geringsten. Speziell die zusätzliche Phasenverschiebung von Objekten außerhalb der Fokusebene wird herausgemittelt und diese dadurch weniger sichtbar.
--> 
Ich bin noch am Rätseln, aber dann wäre ein optimal eingestelltes Mikroskop bei durchsichtigen Phasenobjekten kontraproduktiv. Nur bei gefärbten Präparaten würde sich eine Auflösungserhöhung ergeben, weil die Intensität steigt.
Kann man dann sagen, dass kurze Laufzeiten im Zentrum zur räumlichen Kohärenz und damit zu einer verstärkenden Interferenz führen. Die Außenbereiche nicht. Diese mitteln sich aus und werden deshalb durch zuziehen der Aperturblende ausgeklammert?
All diese Verfahren verringern die Licht-Intensität.

Daraus folgt, dass eine Beleuchtung mit teilweise reduziertem Beleuchtungswinkel wie z.B. ein zentral abgeblendeter Kondensor oder eine ringförmige Beleuchtung bezüglich der Interferenzeffekte bei der Bildentstehung zumindest teilweise kohärent sind im Vergleich zu einem voll aufgeblendeten Kondensor. Und damit entsteht auch die kontrastreichere Abbildung von außerhalb der Brennebene liegenden Phasenobjekten.

Beim Phasenkontrastverfahren nach Zernike hat man durch die ringförmige Blende ebenfalls eine erhöhte Kohärenz bei der Abbildung und auch die bekannte geringe Selektivität der Phasendarstellung in der Objekttiefe. Der erhöhte Bildkontrast gegenüber normalem Hellfeld entsteht durch die Abschwächung der im Normalfall zu intensiven 0. Beugungsordung mit Hilfe der Phasenblende sowie dessen Phasenverschiebung um etwa ±90° (je nach System).



ZitatMan sagt ja, bei der schiefen Beleuchtung kommen mehr Maxima ins Objektiv, weil der Strahlengang aus dem Zentrum verschoben wurde. Das ergibt eine seitige Erhöhung der Auflösung. Warum funktioniert die schiefe Beleuchtung bei Phasenobjekten überhaupt. Wie soll es etwas schärfer werden, wenn es keinen Kontrast hat.
Kann die schiefe Beleuchtung dann doch Phasenobjekte auflösen ?
Die letzte Frage ist doch etwas ungewöhnlich, denn hier geht es dauernd um Bildbeispiele von Phasenobjektien, auch genügend Vergleichsbilder zwischen DIK und schiefer Beleuchtung. 
Ich spare mir jetzt Erläuterungen dazu, hier gibt es eine (sicher nicht einfach verständliche) mathematische Beschreibung der Funktion der schiefen Beleuchtung
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40948.msg301649;topicseen#msg301649

oder Du liest besser den ganzen Beitrag von Anfang an durch. Eine einfache bildhafte Beschreibung mit wenigen Sätzen, wie ich sie aus einigen Artikeln kenne, führt regelmäßig zu falschen physikalischen Begründungen.

--> 
Schiefe Beleuchtung, viele Formeln: da habe ich noch was vor.
"Die eigentliche Bedeutung der schiefen Beleuchtung liegt in seiner Wirkung als Phasenkontrastverfahren."
das nehme ich mal so mit"

Vielen Dank auf jeden Fall für die Antworten.

Liebe Grüße
Rudolf