Schiefe Beleuchtung

[Peter V.]

Hallo Hubert,

ich spreche Hubert im initialen Post bereits konkret an, da dieser Thread sich auf eine etwas vom Thema abgewichene Diskussion in diesem Faden

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=51463.0

bezieht.

Die Frage von Hubert (an mich) war, wieso ich - wenn mich Gradienten stören - nicht auf ein gradientenfreies Verfahren wie die Schiefe Beleuchtung ausweiche.

Ich gebe zu, mich weder theoretisch noch im Übermaß praktisch mit der Schiefen Beleuchtung auseinandergesetzt zu haben. Zweifellos gibt es Unmenegen von Beiträgen (oft eher umfangreiche psysikalisch-optische Betrachtungen) hierzu wie beispielsweise den Beitrag von Thilo Bauer in der Zeitschrift "Mikroskopie". Mir geht es hingegen mehr um die praktische Umsetzung.

Vor (mein Gott, es ist schon 15 Jahre her!) habe ich mal ein wenig mit der Schiefen Beleuchtung herumgespielt:

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=5094.msg34452#msg34452

Mir ist es jedoch nicht gelungen, bei Vergößerung jenseits ca. 40x (also bei höheren Aperturen) einen vernünftigen Schieflichteffekt zu erzeugen. Vielleicht mache ich etwas falsch? Auch heute habe ich es (auf die Schnelle) einmal an einem Jenaval ausprobiert. Nicht mit speziellen Blenden, sondern mit dem Herausdrehen der Revolverscheibe eines Revolverkondensors aus der Rastposition (wie auch seinerzeit bei bem Diatomeenbild am Orhtoplan).

Auch heute bekomme ich am Jenaval mit dem 40x-Objektiv ein noch brauchbares Schieflichtbild, beim 50x -Wasserimmersionsobjektiv gelingt mir das nicht mehr.

Die Beispielbilder zeigen:

1) 40x Schieflicht
2) 50x Schieflicht
3) 50x DIC

Meine Frage an Hubert (und alle Wissenden): Wie bekomme ich denn nun eine brauchbare Schiefe Beleuchtung bei der Verwedung höheraperturiger Objektive (üblicherweise 63x, 100x mit den entsprechenden üblichen Aperturen)? Hier würden mich Beispielsbilder aus dem "echten Mikroskopikerleben" interessieren (keine Glaskügelchen  )

Vielleicht kann Hubert mal an einem typischen Objekt (eben den Mundschleimhautzellen, die jeder kennt) Bilder mit entsprechenden Objektiven und Schiefer Beleuchtung zeigen?

Wie sähe denn ein "komfortables" Setup eines Mikroskops aus, mit dem ich über alle üblichen Vergrößerungen schief beleuchten kann?

Herzliche Grüße
Peter

40x Schief



50x WI Schief



50x DIC

[Florian D.]

Inwiefern ist schiefe Beleuchtung gradientenfrei?
Viele Grüsse
Florian

[Peter V.]

Hallo Florian,

ich möchte nicht unkorrekt zitieren. Hubert schrieb ,,helligkeitsgradientenfrei".

Herzliche Grüße
Peter

[Florian D.]

Lieber Peter,
Ich verstehe, es geht also um den Hintergrund.
VG
Florian

[Peter Reil]

Hallo,

meine Erfahrung mit Schiefer Beleuchtung ist ganz einfacher Natur. Ich habe weder gerechnet, noch irgendwelche physikalisch wichtigen Formeln angewendet. Ich habe es einfach ausprobiert. 

Die Effekte, die ich bis zum 40x Objektiv erzielen konnte sind DIK-ähnlich. Darüber hinaus klappt es nicht.
Es ist eine schöne Spielerei und wenn man es darauf anlegt, kann man DIK vortäuschen - sogar gradientenfrei (wenn man das unbedingt will).

Es gibt meiner Meinung nach zwei Probleme bei Schiefer Beleuchtung :
- Eine wiederholte Darstellung bringt nicht genau die gleichen Ergebnisse. Die Blende muss auf das jeweilige Objekt stets nachjustiert werden. Für mich eine Fummelei.
- Über 40x nicht anwendbar.

Deshalb finde ich den DIK vernünftiger (wenn man den Preis dafür außer acht lässt).
Die Ergebnisse sind stets nachvollziehbar von gleichbleibender Qualität.

Freundliche Grüße
Peter

PS: Wenn mir jemand glaubhaft belegt, dass er mit Schiefer Beleuchtung und gleichzeitig einfachster Bedienung qualitätsidentische Bilder erzielt, wäre ich sogar bereit, meinen DIK abzugeben. 

[Jürgen H.]

Guten Tag zusammen, ich dachte, ein wesentlicher Vorteil von DIK gegenüber schiefer Beleuchtung bestünde in seiner Fähigkeit, optische Schnitte erzeugen zu können?

Viele Grüße

Jürgen

[Michael Müller]

Hallo Peter,

ob schiefe Beleuchtung - auch beim 100er - gut kappt, hängt sehr stark von Deinem Setup und der Position und Form der Blende ab. Ich habe das mal beim Ortholux II vorgestellt (Beitrag #19):

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=32851.15 

Mit diesem Setup klappt schiefe Beleuchtung und Dunkelfeld sehr gut auch mit dem 100er-Objektiv. Je nach Objektiv muss man da aber immer die richtigen Blendeneinstellungen wählen.

DIK ist aber besser.

Viele Grüße

Michael

[Jürgen Boschert]

Hallo Michael,

... und in Deinen beiden Beispielbildern für schiefe Beleuchtung sind sie wieder: Die von Peter monierten Streifenartefakte, nebenbei, die Bilder finde ich trotzdem schön.

Man muss es wirklich nebeneinander live sehen: Insgesamt ist DIC ansprechender und vor allem reproduzierbar und leichter zu handhaben, da stimme ich absolut mit den Petern (Voigt und Reil) überein. Und -Jürgen H. hat das schon angeführt- man kann damit wirklich astreine optische Schnitte erzielen.
Was ich darüber hinaus  persönlich besonders beeindruckend an DIC finde: Die Objekte scheinen geradezu von innen heraus zu strahlen, im Schieflicht sind sie eher etwas flau.

[Peter V.]

Hallo,

"Eine Leben ohne DIK ist möglich und auch nicht sinnlos"  Zweifelsohne kann man mit der Schiefen Beleuchtung viel erreichen, wenn auch teilweise mit deutlich mehr "Gefrickel", vor allem bei höheren Vergrößerungen. Und natürlich muss nicht jeder tümpelnde Hobbymikroskopiker DIK haben. Aber mit DIK ist es einfacher und...na ja, "schöner" und ohne diese Streifenartefakte. Hubert ist bekanntermaßen "Fan" der Schiefen Beleuchtung, aber manche seiner Äußerungen in dem ursprünglichen Thread kann ich nicht komplett nachvollziehen.

Herzliche Grüße
Peter

[rlu]

Hallo,

bis vor kurzem dachte ich, dass die schiefe Beleuchtung nur schief beleuchtet und deshalb Schatten entstehen. Aber scheinbar ist es ähnlich wie beim DIK, dass es Phasenobjekte auflösen kann.
Ich verstehe aber die Theorie noch nicht dahinter.***
+optische Schnitte(Jürgen)

Fordere: Günstige DIK's für alle.

***
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=373674
Ich spare mir jetzt Erläuterungen dazu, hier gibt es eine (sicher nicht einfach verständliche) mathematische Beschreibung der Funktion der schiefen Beleuchtung
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40948.msg301649;topicseen#msg301649


https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=375404

Wie Günther sagt: hab´ halt keine schickimicki-objektive wie viele hier ! 

Liebe Grüße
Rudolf

[Ole Riemann]

Lieber Peter,

Ich habe mich eben mit Objekten aus dem "echten Mikroskopikerleben" wie Du sagst beschäftigt und kann noch einen Vergleich Hellfeld - DIC - schräge Beleuchtung beisteuern. Insbesondere vor dem Hintergrund Deiner Frage nach schräger Beleuchtung bei höheraperturigen Objektiven.

Für die folgenden unbearbeiteten, nur zurechtgeschnittenen und gemeinsam arrangierten Bilder kamen ein ZEISS Plan Apo 25/0,65 und ein ZEISS Plan Apo 63/1,4 (endlich, am Standard WL) zum Einsatz. Schräglicht habe ich mit teilweise verdrehter Revolverscheibe des Revolverkondensors INKO N.A. 1,4 erzeugt, wobei die Objektivaustrittspupille dann +/- halb ausgeleuchtet war. Bei Einsatz des Plan Apo 63/1,4 habe ich die Kondensorfrontlinse mit Aqua dest. immergiert. Die Reihenfolge der Bilder ist HF - DIC - schräge Beleuchtung.

Dauerpräparat von Plationus patulus, das Hellfeldbild (links) mit etwas geschlossener Aperturblende (die übliche 2/3-Regel), Objektiv 25/0,65:



Epidermispanzer von Plationus patulus, gelb umrandet Kerne + Nukleoli in der Epidermis (63/1,4):



Lepadella spec., gelb umrandet Region der Magendrüsen, vermutlich Vesikel mit Verdauungsenzymen, Pr=Protonephridialsystem (63/1,4):



In meiner Mikroskopie-Praxis kommen Hellfeld, DIC und schräge Beleuchtung gleichermaßen zum Einsatz. Bei der schrägen Beleuchtung schätze ich, dass sie sehr dicht beieinander liegende, sich wiederholende und linear angeordnete Strukturen sehr gut darstellen kann. Wichtig ist dies z.B. bei der Bestimmung von Closterien (Mondalgen). Hier zählt man üblicherweise die Zahl der Zellwandstreifen pro 10 µm.

Schöne Grüße

Ole

[Lupus]

Hallo,

jedes Beleuchtungsverfahren muss gewisse Voraussetzungen im optischen Aufbau erfüllen. DIK funktioniert auch nicht richtig wenn es nicht sorgfältig einjustiert wird und die Komponenten nicht passen. Und beim Zernike-Phasenkontrast muss die Blende den richtigen Durchmesser haben und an der optimalen Stelle sitzen. Aber bei den kommerziellen Systemen werden die Komponenten wenigstens vom Hersteller richtig dimensioniert.

Das Problem mit schiefer Beleuchtung ist, dass sie bei geringen Ansprüchen immer irgendwie funktioniert, egal ob man den Kondensor verschiebt, die Beleuchtung über der Leuchtfeldblende unsymmetrisch macht, oder auch eine beliebige nicht-symmetrische Blende unterhalb des Kondensors montiert. Dass dann bei jedem je nach willkürlicher Einstellung etwas anderes heraus kommt ist eigentlich nicht verwunderlich. Wenn man aber die notwendigen optischen "Spielregeln" einhält ist das Ergebnis absolut reproduzierbar, und es wird nicht nur DIK "vorgetäuscht".

Die Anforderungen an die optimalen Kriterien des Strahlenganges wachsen mit zunehmender NA, das kennt eigentlich jeder der einen nicht achromatisch-aplanatischen Kondensor verwendet und sich auch regelmäßig die Zeit nimmt um die Objektivausleuchtung in der hinteren Brennebene zu prüfen. Und dann feststellen muss dass bereits die Höhenstellung dieser Kondensoren an die NA des Objektivs angepasst werden müsste.

Bei optimaler schiefer Beleuchtung muss u.a. die hintere Objektivbrennebene bis zum Rand ausgeleuchtet werden - im Gegensatz zum beliebten teilweisen Abblenden der Kondensorapertur bei Phasenobjekten, was da bekanntlich den Kontrast (auf Kosten der Auflösung) erhöht. Ich bin mir ziemlich sicher, dass bei erfolglosen Versuchen mit schiefer Beleuchtung i.V. mit Immersionsobjektiven der Kondensor nicht immergiert wurde. Das kann nicht funktionieren weil das Funktionsprinzip ein anderes ist. Bei normaler Hellfeldbeobachtung erhöht die Reduzierung der NA des Kondensors die Kohärenz des Lichts, dadurch interferieren die Wellen "effektiver" und damit kontrastreicher auch bei geringen Phasenverschiebungen. Bei schiefer Beleuchtung soll dagegen die Beleuchtungs-Kohärenz minimal sein (NA_Kondensor=NA_Objektiv, dadurch wird auch die Tiefenschärfe für Phasenobjekte gering, fast wie beim DIK), stattdessen soll der Beleuchtungswinkel möglichst genau halbiert werden damit die gebeugten Objektwellen, die vom Objektiv mit voller NA erfasst werden, nur mit genau der Hälfte der Hintergrundbeleuchtung (Beugung 0-ter Ordnung) zum Bild interferieren müssen.

Wer beim DIK bei Immersionsobjektiven diese - analog zur häufigen Vorgehensweise bei normaler Hellfeldbeleuchtung - nicht immergiert hat nicht den Vorteil der Kontrasterhöhung der reduzierten Kondensorapertur, weil DIK ja selbst das Kontrastverfahren ist, aber eine reduzierte Auflösung.

D.h. ein Mindestmaß an Sorgfalt und Grundkenntnissen ist bei schiefer Beleuchtung ebenfalls erforderlich.

Hubert

[Peter T.]

Hallo Ole,

das halte ich für einen ganz wichtigen Beitrag zu diesem Thema. Möglicherweise handelt es sich ja beim Thema DIK und schiefe Beleuchtung nicht um ein Entweder-oder, sondern ein Sowohl-als auch.

[Peter T.]

Hallo Hubert,

wie von Peter V. angeregt, wären hier Beispielbilder (wie die von Ole) für die Bewertung zielführender. Von Deinen Ausführungen verstehe ich etwa 25%.Vielleicht sind es auch nur 20%.

[purkinje]

Hallo,
Oles fantastische Bilder dürften klar zeigen was möglich ist. In Zeiten vor Phako und DIK war ja der Abbesche Beleuchtungsapparat zur schiefen Beleuchtung, neben dem Dunkelfeld ein weitverbreites optische Kontrastverfahren für die ungefärbte und schnelle Erregerdiagnostik, dieser hatte eigentlich immer diese hochaperturigen Immersions-Kondensorköpfe 1,2-1,4, nicht ohne Grund wie Hubert gut erläutert hat.


Ich finde ja auch immer interessant, dass bei Fragen zur Optimierung, v.a. von Neulingen, die Verwendung eines Hilfsmikroskops eigentlich nur bei Phako-Einstellungen mal Erwähnung findet, bei Justage anderen Kontrastverfahren ob DIK, schiefer Beleuchtung oder "nur" Hellfeld eher selten. Ein deutlich unterbewertetes Helferlein.

Falls jemand den oben erwähnten, ich finde nicht zu theoretischen Aufsatz von Thilo Bauer zur perfekten schiefen Beleuchtung lesen möchte: hier dowloadbar.
Beste Grüße Stefan