Schiefe Beleuchtung

[Peter V.]

Hallo,

also, es hat sich schon insofern für mich gelohnt, diesen Thread zu eröffnen, da ich nunmehr gelernt habe, dass auch mit Objektiven deutlich jenseits der Apertur 0.8 eine gute, ja so gar sehr gute Schieflichtbeleuchtung möglich ist. Ich war tatsächlich bislang der Anischt, dass das nicht funktioniert. Man muss aber auch konstatieren, dass es bei manchen Anwedern sehr gut (Ole, Kurt) funktioniert und bei anderen nicht, obgleich ich Jürgen Boschert ja nun wirklich zutraue, alles korrekt einzustellen. Woran das letztlich liegt, ist mir unklar. Es scheint Setups zu geben, bei denen es einfach nicht so gut funktioniert. Anscheinend sind manche Kondensorkonstruktionen nicht geeignet?
Jedenfalls bin ich über Kurts und speziell Oles Ergebnisse verblüfft! Auch Annes Diatomme ist ja unglaublich.

@Ole: Wie hast Du denn jetzt das Schieflicht genau erzeugt und mit welchem Kondensor? Hast Du eine spezielle Blende benutzt oder auch nur den Revolverkondensor aus der Rastposition herausgedreht? Hast Du den K. mit Öl oder Wasser immergiert?

@Hubert: Du hast sicher recht, dass es eben letztlich mehr oder weniger "Bastellösungen" sind, mit denen Schieflicht erzeugt wird und manche dieser Basteleien offenbar besser und andere schlechter sind.
Wenn es von der Industrie vorgefertigte und justierte Systeme gäbe (Du erwähntest es in Analogie zu den Phasenblenden), wäre es auch nicht so eine umständliche Herumpröbelei und es wäre ähnlich komfortabel einzusetzen wie DIC. Aber so etwas gibt es ja wohl nicht auf dem Markt.

Jedenfalls werde ich es jetzt auch mal ausprobieren, ich werde ja wohl auch irgendwo einen immergierbaren Revolverkondensor haben..

Herzliche Grüße
Peter

[A. Büschlen]

Hallo,

von Wild Heerbrugg gab es einen Achromatisch-aplanatischer Kondensor n.A. 0,70/0,95/1,30 mit auswechselbaren Frontlinsen. Dieser Kondensor verfügt über einen 360Grad drehbaren  Einschub für eine keilförmige Blende.
Gibt es damit Erfahrungen in Sachen schiefe Beleuchtung?

Anmerkung: aus meiner Sicht könnte die keilförmige Blende durch einen optimierten Eigenbau ersetzt werden. Und, dieser Kondensor hat 39mm Steckfassung.

Grüsse Arnold Büschlen

[Spectrum]

Hallo Peter (V),
Von Lomo, und ich glaube auch Zeiss Jena, gab es zumindest diesen explizit für Schräglicht gebauten Kondensor, allerdings mit Apertur 1.25 und auch nur kreisrunden Öffnung, dafür aber mit Skala und zumindest grob reproduzierbar:

Leider fehlt mir noch eine Adapterhülse um diesen Kondensor an dem Zeiss Wl zu montieren.
Sonst hätte ich schnell mal Aufnahmen damit gemacht.
Ich weiß auch nicht ob es beleuchtungsseitig Unterschiede bei Zeiss WL und Lomo gab, die hier eine Rolle spielen.
Hat jemand so einen einsatzbereit?
Optimalerweise am dafür vorgesehenen Stativ?
Grüße Holger

[Wutsdorff Peter]

Grüß´ Dich Holger,
wie sollte die Adapterhülse aussehen?
Sende mir eine  Skizze, dann kann ich sehen, ob ich Dir eine fertigen kann.
Gruß Peter W

[Ole Riemann]

... Danke, Hubert, für die Anpassung meiner Schräglichtaufnahme an das DIC-Pendant. Auch ich bin, wie Peter, überrascht und hätte dieses Ergebnis so nicht für möglich gehalten, obwohl ich die schräge Beleuchtung ja durchaus regelmäßig in meinem Mikroskopie-Alltag nutze.

Peter, ich habe den Revolverkondensor ZEISS achr. apl. N.A. 1,4 INKO (neuere Version mit separaten Schieberchen pro Objektiv im DIC) genutzt und Schräglicht durch Drehen des Kondensors aus der Rastposition für Hellfeld heraus eingestellt. Die Frontlinse habe ich mit destilliertem Wasser immergiert. Wichtig ist zu kontrollieren, dass die hintere Objektivbrennebene wirklich maximal ausgeleuchtet ist. Hierfür muss ich bei mir am Standard WL den Kondensor noch über die Köhler-Einstellung (Ränder der LFB scharf) hinaus nach oben bewegen, bis zum oberen Anschlag, und die LFB etwas öffnen. Erst dann ist die Beleuchtungsapertur maximal und das Schräglicht bei der Ölimmersion mit Gewinnn einzusetzen. Kameraseitig nutze ich eine ZEISS Relaisoptik f=63mm und das Kpl8x bei der Canon EOS 700D.


Schöne Grüße

Ole

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Zusammen,

ich habe mit großem Interesse mitgelesen und war dabei über einige der schiefen Beleuchtungs Bsp sehr erstaunt (ganz großes Kino ).

Aber im Prinzip ist an Inversen Mikroskopen das ganze recht häufig zufinden, verschiedene Systeme und Hersteller.

Hier wird das im Forum besprochen: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=48841.0

liebe Grüße

Daniel

[purkinje]

Hallo
@Kurt und @Ole Riemann: habt ihr bei euren (tollen!) hochaperturigen Bildern beim Einstellen eures Schieflichtes am Blendenrand eine scharfe Kante oder eher einen schmalen diffusen Übergang, wie zB. hier bemerkt?

@Daniel
Da sind wir bei Inversen Mikroskopen mit ihren Plastikschalen mit herkömmlicher DIK-Mikroskopie wegen des doppelbrechenden Plastiks schnell im Bereich moderner Kunst; dort spielen schiefe Beleuchtung, der verwandte Hoffmansche Modulationskontrast oder falls Geld vorhanden der edle PlasDIK ihren Vorteil aus. Es kommen aber in der Regel auch nur Objektive mit Aperturen bis etwa 0,6 zur Anwendung.
Beste Grüße Stefan

[Lupus]

Hallo,

Wichtig ist zu kontrollieren, dass die hintere Objektivbrennebene wirklich maximal ausgeleuchtet ist. Hierfür muss ich bei mir am Standard WL den Kondensor noch über die Köhler-Einstellung (Ränder der LFB scharf) hinaus nach oben bewegen, bis zum oberen Anschlag, und die LFB etwas öffnen. Erst dann ist die Beleuchtungsapertur maximal und das Schräglicht bei der Ölimmersion mit Gewinnn einzusetzen.

ja, so ist es. So oft der Hinweis schon wiederholt wurde, so oft wird er nach meinem Gefühl trotzdem ignoriert.
Ich habe hier im Forum früher auch schon gelegentlich als Anleitung gelesen, dass man den Kondensor in der Höhe so stellt, dass die Leuchtfeldblende scharf abgebildet wird. Das ist in der Regel falsch, weil das Beleuchtungs-System nie so genau abgestimmt ist dass sich dadurch die exakt richtige Kondensorhöhe ergibt - jedenfalls bei höherer NA.
Einerseits ist es ziemlich egal, ob die Leuchtfeldblende perfekt scharf in der Objektebene abgebildet wird oder nicht, durch Abweichungen leidet die Streulichtunterdrückung nicht (über deren Relevanz kann man streiten).
Andererseits ist die Kondensorposition kritisch, wir reden davon dass bei einem 100/1,25 Objektiv nur typisch 0.2 mm Objektdurchmesser mit einen sehr flachen Kondensor-Beleuchtungskegel von 113° ausgeleuchtet ist. Da kann sich jeder vorstellen dass die Kondensorhöhe genau passen muss, und das geht eben nicht so einfach indirekt durch Scharfstellen der Leuchtfeldblende falls die Komponenten bezüglich Brennweite und Abstand nicht perfekt aufeinander abgestimmt sind.

Hubert

[rhamvossen]

Hallo Hubert,

Ich finde dass das Bild mit schiefer Beleuchtung die Strukturen differenzierter in der Helligkeit wiedergibt (das DIK-Bild wirkt teilweise in den Lichtern fast "ausgefressen" obwohl es von der Belichtung gut in der Histogrammmitte liegt). Es ist auf keinen Fall schlechter als das DIK-Bild, es wirkt auch etwas schärfer!

Volle Zustimmung. Ausserdam sehe ich einen Blaustich im DIK Bild den ich nicht sehe im Schieflichtbild. Woher kommt denn das? Eigenlicht sollte man mindestens ein Paar Bilder (z.B. 4 Aufnahmen) mit jedes Beleuchtungsverfaheren machen und dann vergleichen. Vielleicht gab es dan von die 4 Bilder noch ein besseres DIK Bild als das hier gezeigte. Beste Grüsse,

Rolf

[Lupus]

Hallo Rolf,

Ole hat erklärt dass er so wenig wie möglich an den Einstellungen geändert hat um die Fokuslage zwischen den beiden Aufnahmen nicht zu verändern, und damit auch keine Veränderung des Weißabgleichs an der Kamera. Dass DIK einen anderen Farbstich erzeugt als normales Hellfeld ist ja nicht ungewöhnlich.

Einen leichten Unterschied dürfte es auch hinsichtlich der Tiefenschärfe zwischen DIK und schiefer Beleuchtung geben, es ist also schwierig absolut identische Aufnahmen bezüglich der Fokussierung zu erhalten. Der Zweck hier war aber primär, nachzuweisen dass schiefe Beleuchtung bei hochaperturigen Immersionsobjektiven die Qualität von DIK erreichen kann.

Außerdem haben verschiedene DIK-Systeme nicht automatisch die gleichen Abbildungseigenschaften. Die können je nach Konstruktion unterschiedlichen Kontrast oder Auflösung besitzen, selbst vom gleichen Hersteller, auch je nach Baujahr. Hier am Beispiel Olympus mit normalem DIK, hochauflösendem DIK und DIK mit hohem Kontrast:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=37743.0

Hubert

[purkinje]

Hallo Hubert und Ole,
mit noch etwas mehr Kontrastverstärkung beim oben gezeigten Schieflichtbild und das passende Detail ausgewählt (Bild oben) hier der Vergleich zu einer der wenigen hochaperturigen Schieflichtbilder die sich in Publikationen finden lassen (Bild unten)


ebenfalls Mundschleimhaut-Epithelie mit Planapo 100/1,3 bei geöltem Kondensor 1,4 (daneben Surirella gemma), Polaroid vom Bildschirm der VideoKamera nach Kontrastverstärkung abfotografiert (1985!)
Q: Kachar B., Asymmetric Illumination Contrast: A Method of Image Formation for Video Light Microscopy, 1985, Science 227(4688):766-8
Euer Bild braucht also den Vergleich zum Science-Paper nicht zu scheuen 
Beste Grüße Stefan

[rhamvossen]

Hallo,

Hier noch mal die schiefe Beleuchtung mit einem Neofluar 63/1.25. Schleimhautzelle in zwei Ebene fokussiert. Kondensor apl achr 1.4, Wasser Immergiert.



Und hier unten mit etwas erhöhter Kontrast, das erste Bild is die Hellfeld-Aufnahme.



Eine Frage für Hubert: der Vorteil von DIK sollte die optische Schnitte sein. Sieht man das mit die schiefe Beleuchtung auch nicht?

Beste Grüsse,

Rolf

[Lupus]

Hallo Rolf,

wenn gesagt wird, dass man mit DIK besonders gut optische Schnitte erhält, dann bezieht sich dieser Vergleich speziell auf das Phasenkontrastverfahren nach Zernike. Denn das ist besonders schlecht geeignet um dickere Phasenobjekte zu beobachten weil die Schichten über und unter der Fokusebene sehr direkt die Intensitätsverteilung in der Fokusebene beeinflussen.
 
Für die schiefe Beleuchtung fehlt mir der genaue quantitative Vergleich ob mit ihr etwas schlechter einzelne Schichten im Objekt beobachtet werden könne als mit DIK. Aber prinzipiell ist schiefe Beleuchtung hier viel vergleichbarer mit DIK als mit Zernike-Phasenkontrast. Nach meinen Beobachtungen lassen sich mit schiefer Beleuchtung sehr gut einzelne optische Schichten getrennt fokussieren, ohne starke Beeinflussung durch höher oder tiefer liegende Schichten (das sieht man im ja auch an Deinem Beispiel).

Voraussetzung ist dabei aber das, was ich schon mehrfach betont habe, nämlich dass die Blendenöffnung für schiefe Beleuchtung möglichst groß bleiben muss um maximal inkohärente Beleuchtung zu erreichen (z.B. eine halbkreisförmige Blende o.ä.). Schmale Blendenformen, besonders ausgeprägt beim Hoffman-Kontrast, verschlechtern die Möglichkeit für optische Schnitte stark. Für optische Schnitte ist aus dem gleichen Grund auch die ringförmige Beleuchtung schlecht.

Hubert

[Peter V.]

Hallo Hubert,

ich habe bei den vielen Beiträgen und Bildbeispielen inzwischen etwas den Überblick verloren. Mir ist nicht ganz klar, wie ich mit dem Phasenteleskop feststelle, ob die hintere Objektivbrennebene maximal ausgeleuchtet ist oder nicht. Oder anders gefragt: Was ist mit der ,,maximalen Ausleuchtung" genau gemeint?  Wenn ich durch das PT schaue, sehe ich doch ohne Blende immer eine runde beleuchtete Fläche bzw. nach Einbringen der Blende oder Verdrehen der Revolverscheibe die noch verbleibende mehr oder weniger halbmondförmige beleuchtete Fläche. Wie sieht es denn im Phasenteleskop aus, wenn die hintere Objektivbrennebene nicht maximal ausgeleuchtet ist? Bisher habe ich bei Schiefer Beleuchtung stets alle Blenden voll geöffnet und den Kondensor maximal hochgefahren (bei der Kondensorimmersion muss er ja ohnehin in der obersten Position sein). Ist das falsch? Wodurch kann denn die hintere Objektivbrennebene nicht maximal ausgeleuchtet sein?

Herzliche Grüße
Peter

[olaf.med]

Lieber Peter,

da klinke ich mich einmal - völlig inkompetent, aber Praxis-vertraut - ein. Die hintere Brennebene, in die Du ja mit dem Phasenteleskop (oder der Bertrand-Linse) schaust, ist der ideale Ort um die Lampenjustierung zu überprüfen. Falsche Justierung bedingt ungleichmäßige Ausleuchtung. Ein treffliches Beispiel dafür sahen wir ja kürzlich bei dem miesen Interferenzbild von D.K. das wir diskutiert hatten.

Aber das weißt Du doch, oder habe ich Deine Frage falsch verstanden?

Herzliche Grüße, Olaf