Schiefe Beleuchtung

[Lupus]

Hallo Michael,

Zusätzlich sollte man bei Fotos immer (!) eine entsprechende Nachbearbeitung mit Flatfield-Korrektur und Kontrastspreizung anwenden. Der Kontrast der Live-Beobachtung und der "unebene" Hintergrund sind dann nicht mehr so ausschlaggebend.

Es gibt sicher einige Mikroskopiker die für die bevorzugte visuelle Beobachtung einen möglichst hohen Anfangskontrast vorziehen. Wenn man allerdings eine fotografische Kontrastspreizung beim Vergleich von DIK mit schiefer Beleuchtung durchführt fällt auf, dass manchmal DIK bereits zu stark kontrastiert und z.B. "ausgefressene" Lichter zeigt, also den Phasenkontrast bereits verzerrt wiedergibt. Man sollte nicht vergessen, dass jedes Phasenkontrastverfahren einen (unterschiedlichen) begrenzten linearen Arbeitsbereich hat. Umgekehrt zeigt schiefe Beleuchtung oft erst nach einer solchen Kontrastspreizung ihr qualitatives Potential.

Ich denke dass die nachträgliche Bildbearbeitung speziell in Form einer Kontrastspreizung nicht irgend einer Automatikfunktion überlassen werden sollte. Vielleicht hier zwei Beispiele möglicher manueller Bearbeitung, nachdem mein Eindruck ist dass einige Mikroskopiker die Verwendung des Histogramms scheuen wie der Teufel das Weihwasser.

Ich habe nochmal den Fokussierungsvergleich von Rolf (Beitrag #79) verwendet um die manuelle Verschiebung der Pixel-Helligkeitswerte im Histogramm im farbigen RGB-Raum zu zeigen. Links oben die Helligkeitsverteilung des Originalbildes. Bei diesem Programm kann man Regler mit der Maus verschieben um festzulegen ab welcher Grenze alle Pixel Schwarz (Intensitätswert 0) oder Weiß (Intensitätswert 255) wiedergegeben werden.

Im konkreten Beispiel wurde, wie die roten Pfeile unter der Grafik links oben zeigen, die Grenzen nach Gefühl auf die Intensitätswerte 120 und 190 geschoben. Dabei sollte keine Sättigung in den Lichtern und Schatten entstehen, d.h. dass sich noch keine Verdichtung (sichtbare Intensitätserhöhung) schwarzer und weißer Pixel an den Rändern der Histogrammverteilung zeigt. Das Ergebnis ist darunter zu sehen, in den Rändern sind nur minimale Peaks zu erkennen. Das zugehörige Foto ist rechts, durch die Spreizung im Farbraum verstärken sich vorhandene Farbabweichungen durch chromatische Aberration speziell in den hellen Bereichen.



Ein anderes Programm zeigt diesmal im Intensitäts-Raum (Einstellung "Luminosity") das im Prinzip gleiche SW-Histogramm links oben. Hier kann man die Übertragungskurve Originalpixelhelligkeit-Bildpixelhelligkeit (diagonale Linie im Histogrammdiagramm) manuell "verbiegen" um u.a. den gleichen Effekt wie im vorigen Beispiel zu erzeugen. Darunter ist die Verschiebung der linearen Übertragungskurve in eine trapezförmige Stufe zu sehen (rote Pfeile), überlagert wieder das Ergebnis.

Die Kammstruktur in der Intensitätsverteilung des bearbeiteten Bildes kommt daher dass durch die Kontrastdehnung Zwischenwerte der ganzzahligen Intensitätswerte von 0 bis 255 (bei 8-bit JPG) fehlen, und dadurch regelmäßige Lücken entstehen - was aber in der Praxis nicht auffällt. Das zugehörige Foto rechts daneben ist jetzt SW, und wirkt bei dem an sich farblosen Objekt dadurch kontrastreicher.



Hubert

[Lupus]

Hallo Stefan,

1) Die Frage beim Optischen Schnitt ist ja, so wie ich es verstanden habe, nicht so sehr die Schärfentiefe, vielmehr was bei der Abbildung der außerhalb des Fokus liegenden Strukturen passiert. Wenn dann diese Strukturen, wie beim gut eingestellten DIK, nicht phasenverschoben werden, grenzen sie sich fast nicht vom Hintergrund ab und es entsteht der Optische Schnitt.
Bei oben gezeigten  Bildern der Mundschleimhaut-Zellen (MSZ) in zwei Fokusebenen in schiefer Beleuchtung werden zwar Zellkern bzw Stäbchenbakterien scharf abgebildet, jedoch kommen die Strukturen jenseits des Fokus, v.a. Zellkern noch deutlich hervor.

Die Schärfentiefe ist aber zunächst einmal der bestimmende Faktor wie unscharf Details außerhalb der Fokusebene abgebildet werden. Einen beliebig scharfen optischen Schnitt gibt es hier nicht, natürlich wird auch beim DIK das Bild durch außerhalb liegende Strukturen mehr oder weniger beeinflusst. Die außerhalb der Fokusebene liegenden Strukturen wirken zwangsläufig phasenverschiebend. Aber dadurch dass der jeweilige Beleuchtungskegel und der Erfassungskegel des Objektivs für die beiden senkrecht polarisierten DIK-Teilbilder nur gering gegeneinander verschoben sind, ist auch die phasenverschiebende Wirkung dieser Strukturen in ihrem unterschiedlichen Anteil am den beiden Gesamtlichtkegeln gering (aber je nach Abstand zur Fokusebene nicht Null).

Das ist bei schiefer Beleuchtung nicht sehr viel anders, der "Phaseninhalt" von Beleuchtungs- und Erfassungskegel zweier nebeneinander liegender Objektpunkte unterscheidet sich ebenfalls nur gering bezüglich außerhalb liegender Strukturen. Etwas ungünstiger bei schiefer Beleuchtung da es sich nicht um einen im Azimut 360° Kegel handelt, sondern je nach Blendenform um einen geringeren Raumwinkel mit etwas erhöhter Kohärenz.

Inwieweit bei der gleichen Mundschleimhautzelle mit DIK die Strukturen außerhalb des Fokus gar nicht oder viel unschärfer erkennbar gewesen wären, wäre noch zu beweisen. 

2) Bei der Kontrastierung des hauptsächlich Phasenobjekts MSZ zeigen sich ohne Nachbearbeitung deutliche Unterschiede; hier scheint mir der DIK deutlich überlegen. Dies könnte an der Einstellmöglichkeit der Phasenverschiebung (Bias) beim DIK liegen.

Man muss auch die Bildauflösung in die Betrachtung einbeziehen. Ich hatte schon mehrfach den Beitrag von Martin Kreutz verlinkt, der die Unterschiede von Kontrast und Auflösung je nach Konstruktion des DIK demonstriert.

Der Kontrast schiefer Beleuchtung lässt sich durch die Blendenform verändern (verbunden mit anderen Nachteilen).

Hubert

[purkinje]

Hallo Hubert,
mir ist als Freund des diskreten Sfumato und nicht der knackigen Kontraste schon klar was Du mir mit

Man muss auch die Bildauflösung in die Betrachtung einbeziehen. Ich hatte schon mehrfach den Beitrag von Martin Kreutz verlinkt, der die Unterschiede von Kontrast und Auflösung je nach Konstruktion des DIK demonstriert.

sagen willst: Den Kontrast kann man noch digital optimieren, die Auflösung nicht. Nur dürften sich viele, auch ich bei der hochap. schiefen Beleuchtung doch etwas mehr analogen Kontrast wünschen 
Der HR /HC Vergleichsbeitrag ist übrigens hier zu finden
Beste Grüße Stefan

[Peter V.]

Hallo,

Hurraaa!! Ich habe es nun auch geschafft! Nicht mit dem INKO-Kondensor, sondern dem Phasenkonrast-Revolverkondensor von Zeiss, Frontlinse achr.aplan.1.3. Ich muss allerdings die beleuchtete Sichel sehr auf den Rands eingrenzen, wohl daher auch hier wieder Streifenartefakte. Mit nur halb eingeschränkter Beleuchtungsapertur tut sich bei mir gar nichts.
Plan 40 und Plan 100, Kondensor und 100er-Objektiv mit Öl immergiert. Nicht so schön wie bei Ole, aber immerhin "schief".
Gut, mal selbst gesehen zu haben, dass es geht, aber mit DIK ists es doch etwas bequemer.

Bilder freihändig mit dem über das Okular gehaltene Handy, nur Farbstich entfernt, sonst keine Bearbeitung. Bilder deutlich verkleinert.

Herzliche Grüße
Peter

[rlu]

Hallo Peter,

Glückwunsch zum "Hurraaa!"
Die hohen Vergrößerungen sind für die schiefe Beleuchtung eine Herausforderung.

Noch eine/einige Frage(n).
1. Hast du den Kondensor mit Wasser oder Öl immergiert, d.h. liegt der Objektträger auf dieser Schicht zwischen Kondensor und Objektträger oder geht es auch ohne?

Also kein selbstgebastelter Filter, sondern "nur" am Kondensor gedreht.
2. Welcher Einsatz von den vielen war es und welche Dreh-Stellung(Blendenbild/Abschattung)? Ein Bild oder Bilder wären schön.
Für das 40x und das 100x falls es Unterschiede gibt.

3. Der Kondensor war dann wo,(vmtl. ganz oben) falls kein Öl verwendet wurde?
Das 100er Objektiv wird ja immer mit Öl "betrieben", klar.

4. Und scheinbar ist es auch wichtig, dass der Kondensor keine normale 0,9 Apertur hat, sondern die höhere mit 1,3 oder sogar 1,4.

5. Kannst du die Artefakte der schiefen Beleuchtung mit der Flatfield-Korrektur rausmitteln?
Du verwendest ja bereit Fiji.

siehe:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=51546.0
Digitale Bildbearbeitung - Flatfield-Korrektur und Kontrastierung

6. Automatisch mit der Wahl vom Drehkondensor war sicher gestellt, dass die Aperturblende ganz offen war, weil nur in der Stellung "J" die Blende funktioniert. Und die wird ja nicht genommmen.

Liebe Grüße
Rudolf

,,Nullius in verba"

[Peter V.]

Hallo Rudolf,

ad 1) ja, Kondensor mit Öl immergiert
ad 2) Revolverscheibe einfach aus der Stellung J nach Gefühl herausgedereht, im Uhrezigersinn
ad 3) Das weiß ich gar nicht mehr genau, entweder ganz oben oder minimal abgesenkt
ad 4) Ja, das ist wohl so
ad 5) Habe ich nicht versucht, war ja nur ein schnelles Smartphone-Foto, freihändig.

Herzliche Grüße
Peter

[Peter V.]

Hallo,

nach der Kornrade muss ich diesen Thread leider noch einmal aufwärmen. Es gab ja hier gewisse Kontroversen. Einerseits Mikroskopiker wie Ole und Rolf, die beeindruckende Bilder mit einem 100er-Objektiv mit Schiefer Beleuchtung gezeigt haben und andererseits Foristen, denen es nicht gelungen ist, mit einem hochaperturigen Objektiv ein befriedigendes Schieflichtbild zu erzeugen. Auf der Kornrade konnte ich es nun mit einem 1.4er achrom.aplan. Kondensor von Olympus, den Ole mitgebracht hatte, an einem 100er SPlan selbst sehen. Mit diesem Kondensor hatte Ole in diesem Thread ein sehr beeindruckendes Foto gezeigt. Ole hat nun auf der Kornrade mein Lieblings-Testobjekt (Mundschleimhautzellen) optimal eingestellt. Am BH2 war eine Kamera angeschlossen und das Livebild auf dem Monitor war in der Tat absolut beeindruckend und für mich verblüffend. Leider habe ich versäumt, es auch zu fotografieren. Nun das große Aber: Bein Blick durch die Okulare war für mich fast nichts zu sehen! Sprich, das Objekt war derart kontrastarm, dass es mit dem bloßen Auge kaum zu erkennen war. Ein krasser Gegensatz zu dem Bild der Kamera, das kontrastreich und von DIC praktisch nicht zu unterscheiden war! Mehrere Kollegen haben ebenfalls ins Mikroskop geschaut und bestätigt, dass sie den Eindruck recht ,,enttäuschend" fanden. Und ,,so" habe ich es an meinen Mikroskopen auch hinbekommen, aber durch die Bilder von Ole und Rolf einfach etwas ganz anderes erwartet. Offenbar verstärkt die Kamera den Kontrast automatisch in einem ganz erheblichen Maße! Mein persönliches Fazit bleibt, dass - zumindest beim Blick durchs das Okular - mit einem hochaperturigen Objektiv kein Schieflichtbild zu erzeugen ist, das mich zufriedenstellen würde.

Herzliche Grüße
Peter

[junio]

Lieber Peter,
schade, dass ich diese Vorführung verpasst habe.

Beste Grüße von Jürgen

[Peter V.]

Lieber Jürgen,

Du kannst Dir den Bildeindruck durch das Okular ungefähr so vorstellen wie mein Bild mit dem 100er in meinem Beitrag #94, während es - eben auch mit dem 100er und Oles Kondensor - vom Kontrast her so aussah wie beim Bild mit dem 40er im Beitrag #94.

Herzliche Grüße
Peter

[purkinje]

Hallo,
der Charme der schiefen Beleuchtung liegt sicher in seiner Einfachheit; auch um das Ganze mathematisch zu fassen und ggf weiter zu bearbeiten oder quantitativ auszuwerten.
Will man hingegen prima vista durchs Okular bei hochaperturigem Schieflicht mehr Kontrast, bleibt die digitale Nachbearbeitung. Oder optisch, wie von Nomarski schon Anfang der 1960er vorgeschlagen die Dämpfung der Amplitude der nullten Ordnung durch Amplitudenfilter, später entwickelten sich hieraus Hoffmans Modulationskontrast und ähnliche "seitenbandmodulierende" Verfahren.
Übrigens gilt auch beim DIK "There is no free lunch", knackiger Differentialkontrast geht  hier umgekehrt mit Auflösungsverlust einher.
Lassen wir mal den Oly HR-DIK außen vor, so kann man bei den noch mit dem 40er Objektiv sehr unterschiedlich kontrastierenden DIKs der verschiedenen Hersteller, beim 100er Objektiv dann sehr einheitliche Kontrastierung beobachten: der Scherabstand wird deutlich kleiner bei den hohen Aperturen, der Grat zwischen Auflösungs- oder Kontrastverlust schmäler.
Beste Grüße Stefan

[Peter V.]

Hallo Stefan,

das mag ja alles sein. Allerdings ist das Ziel des (Hobby-)Mikroskopikers üblicherweise nicht, irgendetwas

mathematisch zu fassen und ggf weiter zu bearbeiten oder quantitativ auszuwerten.

In der Regel möchte man doch mit der Schiefen Beleuchtung ein brauchbares Bild im Okular bekommen und das ist - zumindest nach meinen Erfahrungen - mit hochaperturigen Objetkiven nur unbefriedigend möglich und ersetzt keinesfalls den DIC.
Aufgrund der gezeigten Bilder von Ole und Rolf Vossen war ich nun verunsichert in meinem Urteil, hatte etwas anderes erwartet und mich einfach nur für zu ungeschickt gehalten, ein solches Bild ebenfalls zu erzeugen. Nun konnte ich aber auf der Kornrade feststellen, dass das Bild im Okular auch mit Oles Setup wirklich so extrem kontrastarm ist, wie ich es auch aus eigenen Versuchen am Phomi kenne und es nur durch die offenbar bereits automatische "Kontrastverstärkung" der Kamerasoftware dem entspricht, was man auch vom DIC kennt.

Damit ist es für mich im praktischen Mikroskopikerleben absolut keine Alternative zum DIC (bei hochaperturigen Objektiven). Das mag aus der Sicht den Optik-Theoretikers oder Physikers anders beurteilt werden; für mich ist "wichtig auf'm Platz" ;-)

Herzliche Grüße
Peter

PS: Ich möchte noch anmerken, dass einige Kollegen, die durchs das Okular geschaut haben (z.B. Olaf), das Bild ebenfalls quasi unbrauchbar fanden, Ole hingegen es als deutlich kontrastreicher empfunden hat; möglicherweise ist die Kontrastempfindung auch sehr subjektiv.

[Lupus]

Hallo,

hoffentlich wird da zwischen DIK und schiefer Beleuchtung auch Gleiches verglichen. Z.B. auch bei DIK immergierter Kondensor mit max. NA.

Ich möchte noch anmerken, dass einige Kollegen, die durchs das Okular geschaut haben (z.B. Olaf), das Bild ebenfalls quasi unbrauchbar fanden, Ole hingegen es als deutlich kontrastreicher empfunden hat; möglicherweise ist die Kontrastempfindung auch sehr subjektiv.

Nach Oles Bildeindruck wollte ich gerade nachfragen. Vielleicht ist bei manchen, die - auch durch ihre Bildbearbeitung - gewohnt sind mit max. Kontrast zu beobachten, das Gefühl für subtile Feinheiten verloren gegangen . Nach meiner Erfahrung kann man aber auch durch ungünstige Beobachtungstechnik speziell bei schiefer Beleuchtung den Kontrast mindern. Z.B. wenn die Beleuchtung ziemlich hell eingestellt ist (was zu minimalem Pupillendurchmesser von bis zu 2 mm führt) und dann auch noch der Okularabstand des Binokulars nicht optimal eingestellt ist. Dann kann die Austrittspupille einseitig beschnitten werden.

Hubert

[M59]

Hallo Peter,

ich nehme an, die Kamera war auf 'Zeitautomatik' eingestellt? Das wäre eine einfache Erklärung für die unterschiedliche Wahrnehmung, da die Kameraautomatik das Bild abdunkeln wird und allein dadurch den Bildeindruck verändert. Z.B. ist es bei meiner Beleuchtung so, dass die Kamerabilder (minimal) besser=neutraler werden, wenn das Okularbild (bei Schieflicht) eher zu hell/wenig kontrastreich ist. Ich denke, dass liegt an der Charakteristik meiner LED.
Für derartige Vergleiche benutzte ich immer dasselbe biologische Präparat, welches ich gut kenne, einen ungefärbten Gewebeschnitt einer Maus, gemäß der von Dir zitierten Fussballweisheit.

Auch wenn eine DIK Ausrüstung vorhanden ist, finde ich es lohnenswert das Objekt ebenso in schiefer Beleuchtung anzusehen bzw. zu fotografieren. Beim Vergleich  DIK/'Schief' möchte ich  nicht behaupten, dass das DIK Bild (Zeiss endlich, Schieber DIK) immer in allen Details 'besser' als das Schieflichtbild ist. Es ist eher so, dass Unterschiede in der Abbildung eine korrekte Interpretation erleichtern.

Zumindest wünscht man sich das....

Grüße, Michael/M59

[Lupus]

Hallo Peter,

noch einige Bemerkungen zum Thema schiefe Beleuchtung mit stark vergrößernden/hochaperturigen Objektiven:

1. Die Physik die hinter der Erzeugung des differentiellen Phasenkontrastes bei schiefer Beleuchtung steckt, ist die selbe egal mit welchem Objektiv man arbeitet.

2. Dass höhere NA i.V. mit höherer Vergrößerung generell auch höhere Ansprüche an den Anwender stellen ist eigentlich bekannt, das beginnt mit der Scharfstellung und endet mit höheren Anforderungen an die Qualität des Kondensors. Viele kennen vermutlich z.B. das Problem mit selbstgebauten Dunkelfeldblenden - mit schwächeren Objektiven als 40/0.65 muss man nicht einmal sehr sauber arbeiten, beim genannten Objektiv sollte die Blende schon gut positioniert sein, und man merkt deutliche Qualitätseinbußen mit nicht aplanatischen Kondensoren, und mit noch höherer NA wird der Eigenbau sehr schwierig.
Bei schiefer Beleuchtung sollte die Blende an optimaler Stelle sitzen. Wenn man bedenkt dass ein Zeiss-Standard Klappkondensor mit NA 0.9 noch etwa 12-13 mm Brennweite hat, ein achromatisch-aplanatischer Kondensor NA 1.4 aber bereits nur noch etwa 6.5 mm, kann man sich vielleicht vorstellen dass die Positionierung der Blende für schiefe Beleuchtung mit abweichenden Brennweitenabstand irgendwo unterhalb des Kondensors nicht immer optimal ist um den Beleuchtungskegel zu kontrollieren.

3. Einen qualitativen Unterschied des Phasenbildes zwischen z.B. einem Trockenobjektiv 40/0.65 und einem Immersionsobjektiv 100/1.25 kann ich persönlich nach eigener Erfahrung nicht erkennen. Dass ein Phasenobjekt mit 2.5fach höherer Vergrößerung mit dem 100er im Okular weniger Kontrastreich wirkt kann - je nach Art des Objekts - kann auch damit zusammenhängen dass mit dem höher auflösenden Objektiv mehr feinere und damit zwangsläufig dünnere Strukturen erkennbar werden, die aber dadurch auch eine geringere optische Phasenverschiebung und somit geringeren Kontrast aufweisen.

4. Beim Vergleich mit DIK muss man berücksichtigen dass bei schiefer Beleuchtung die NA des Objektivs in Teilbereichen bis zum Rand ausgeleuchtet werden sollte. Wer DIK mit nicht-immergiertem Kondensor betreibt erhält ein nicht vergleichbares Bild, da hier die Beleuchtungsapertur zwangsläufig nur etwa 2/3 der maximal möglichen ist mit damit verbundener Auflösungsminderung und geändertem Bildkontrast.

5. Wie schon erwähnt erfordert schiefe Beleuchtung einen sorgfältigen, zentrierten Blick ins Okular - speziell wenn die Beleuchtung hell eingestellt ist und die Augenpupillen auf minimalen Durchmesser verengt sind. Ich verwende hier immer deutlich reduzierte Beleuchtungsintensität, auch ganz allgemein um (altersbedingte) störende Effekte durch Mouches volantes bei größerem Pupillendurchmesser zu minimieren. Den Effekt des einseitigen "Anschneidens" der Okular-Austrittspupille durch die Augenpupille und die verbundene Änderung der Bildkontrastes bei schiefer Beleuchtung kann man am Besten am monokularen Mikroskop testen.
Zeiss hat das Beschneiden der Okular-Austrittspupille Anfang des 20.Jh. verwendet um einen Vorläufer des späteren Stereomikroskops vom Fernrohr-Typ (im englisch-sprachigen Raum auch als CMO = Common Main Objektive bezeichnet) zum Verkauf anzubieten. Dabei wurden zwei halbkreisförmige Blenden auf die Okulare eines Binokularaufsatzes montiert um für jedes Auge nur die jeweils andere Hälfte des NA-Kegels des Objektivs zugänglich zu machen.   http://www.antique-microscopes.com/photos/Bitumi.pdf
Diesen Stereoeffekt kann man am Binokular ohne diese Blenden (unbequem) simulieren indem man den Okularabstand um den Austrittspupillendurchmesser verkleinert. Womit wir wieder beim möglichen Kontrastproblem mit schiefer Beleuchtung am Binokular sind.

Hubert