UV-Mikroskopie mit Leica Spezialobjektiv 150x/0.90 365nm

[TStein]

Hallo liebe Mikroskopiebegeisterte,

ich habe am Wochenende mal auf die Schnelle mein kürzlich erworbenes Leica 150x/0.90 365nm Objektiv an meinem Leica DMRXE im Auflicht getestet. Ich kenne diesen Objektivtyp etwas besser, da wir auf Arbeit an einem Waferinspektionsmikroskop solch ein Teil haben. 
Dazu habe ich die Standard-Lampe erstmal provisorisch auf eine Nichia NCSU033b mit 0,3W@365nm umgebaut. Hatte noch einige Gebrauchte von diesen älteren LEDs da, ... zum Testen. Aber hab gleich zur Sicherheit noch ein "Pärchen" aktuelle NCSU276 mit 1W@365nm besorgt. Aber die 0,3W-Variante funktioniert schon besser als gedacht. Die Homogenität der Ausleuchtung lässt noch etwas zu wünschen übrig, schaue ich mir aber zu gegebener Zeit nochmal an. Als Bildbearbeitung wurde aber der Bildhintergrund geebnet, sodass das Problem in den eingehängten Bildern nicht auftritt. 
Kamera ist eine Basler Industriekamera mit monochromen IMX174 mit Direktadaption. Ist ausreichend empfindlich, obwohl der CMOS-Sensor nicht besonders aktuell und auch noch nicht Back-Illuminated ist.
Das Testobjekt ist ein Auflösungstest mit maximal 4500Lp/mm, was dann 222nm Periode, bzw. 110nm CD entspricht.
Hab dann auch gleichmal meine anderen "normalen" Objektive im VIS und bei 365nm durchprobiert.

Als erstes das Leica 150x/0.90 365nm @365nm:


Dann ein Auflicht Leica HC PL-Fluotar 100x/0.90 BD @365nm:


Und zum Vergleich nochmal das Auflicht Leica HC PL-Fluotar 100x/0.90 BD im VIS:


Und zum Abschluss ein Auflicht Leica PL-Apo 150x/0.90 BD im VIS:


Im VIS kommen die beiden Standardobjektive bei einer NA von 0.90 auf etwa 3000Lp/mm, was in etwa zu erwarten war. Das HC PL-Fluotar 100x/0.90 BD ist bei 365nm schon ziemlich kontrastschwach, aber die Auflösung ist etwas höher als im VIS, so 3500Lp/mm.
Das spezielle 365nm Objektiv löst die 4000Lp/mm auf und auch bei 4500Lp/mm ist eine schwache Modulation erkennbar. Der Kontrast ist auch ziemlich gut, besser als das 150x Apo im VIS. Im Prinzip wäre die zu erwartende Grenzauflösung etwa 365nm / (2 * 0.90) = 203nm, also 4900Lp/mm.

Es gibt diese speziellen Objektive übrigens auch als 150x/0.90 248nm, also fürs Deep-UV. Hätten dann etwa 138nm Auflösung, also 7200Lp/mm. Hat schonmal jemand sich im DUV versucht? Bei 365nm wurde ja schon einiges ausprobiert.
LEDs mit einigen 10er mW @248nm gibts übrigens nichtmal sehr teuer. Bei Kameras weiß ich nicht genau, wie weit die aktuellen monochromen Modelle, bspw ohne Deckglas kommen. Zumindest Sony hat einen speziellen UV-Sensor im Angebot, den IMX487. Ist nicht ganz billig, aber geht anscheinend bis 200nm runter. Und normale Strahlteiler aus gewöhnlichen Glas, bspw N-BK7 usw. machen so ab 350nm dicht. Sollte dann nur noch Quarzglas, bzw. Calziumfluorid im Strahlengang sein. Die 365nm Version kann man noch ohne großen Aufwand nutzen, bei 248nm muss wohl das Mikroskop deutlich umgebaut werden. Na mal schauen, ob ich mir die recht teuere Spielerei mal antue.

Lg Tino           

[Nochnmikroskop]

Hallo Tino,
 
ich finde Deine Vergleiche sehr interessant, danke für Deine Mühen.
 
Welche Anwendung hast Du denn privat für diese hohen Vergrößerungen?
 
Wenn Du nicht soweit in den UVC Bereich herunter gehst, so bis 300nm, dann könnte als Kamera z.B. eine Canon EOS mit Forensik-Umbau eine Alternative sein. Der Sensor soll lt. den Unternehmen, welche diese Umbauten durchführen ab 300nm bis 320nm UV empfindlich sein. Gebrauchte Kamera incl. Umbau gibt es schon unter 400 Euro (Händler, mit Garantie).
 
Wenn man dann das Licht per halbdurchlässigen Spiegel koaxial in einen Tubus (Alibaba, etc) einspeist (Glas???) dann wird nur minimales Glas benötigt, also wie beim typischen Stackeraufbau. Man braucht lediglich eine Tubuslinse, oder bei endlich Objektiven nicht einmal diese.
 
So ist der Aufwand überschaubar, wenn man schon eine Stackvorrichtung hat. Allerdings sind die Schärfentiefen ja sehr gering, da geht man gerne an die praktisch spielfreie Feinverstellung des Miks.
 
LG Frank
 
Beispiel von Thorlabs
 

[TStein]

Hallo Frank, hallo ins Forum,

ich schaffe es leider erst jetzt zu antworten.
Eine richtige Anwendung für die hochauflösende UV-Mikroskopie im Auflicht hab ich im Grunde nicht, alles nur interessenhalber fürs Hobby.

Aber als erstes habe ich den UV-Lampenumbau finalisiert und die Beleuchtung richtig eingestellt.
Jetzt ist auch die 4500Lp/mm etwas besser aufgelöst:



Hab heute auch gleich mal einen alten Pentium4-Prozessor 386DX40 mit 1.5 Micron Fertigungstechnologie geöffnet, um mal den DIC im UV auszuprobieren. Das Objektiv ist übrigens für ein D-Prisma vorgesehen. Mit DIC geht aber der Kamera ganz langsam das Licht aus, muss man schon mindestens 0,5s Belichtungszeit einstellen.

Anbei ein paar Impressionen:

Bild1: HC-PL Fluotar 20x/0.50 @365nm:


Bild2: PL Fluotar 50x/0.80 @365nm:


Bild3: HC-PL Fluotar 100x/0.90 @365nm:


Bild5: UV150x/0.90 @365nm:


Bild6: UV150x/0.90 @365nm DIC-D Stellung1:


Bild7: UV150x/0.90 @365nm DIC-D Stellung2:


Bin nach einer eingehenden Recherche doch am überlegen, ob sich noch kürzere Wellenlängen wirklich lohnen. Bei unter 300nm Wellenlänge gibts bspw. Probleme mit dem Linsenkleber (Eintrübung), sodass im 248nm-Spezialobjektiv nur noch Luftspalt-Linsengruppen verwendet werden. Neuere backilluminated Sony-IMX-Kamerasensoren vom Starvis 1/2, bzw. Pregius 2/3/4 sind übrigens lt. EMVA schon prinzipiell bis ~300nm empfindlich. Meine verwendete Kamera hat einen frontilluminated Pregius1-Sensor (IMX174), hätte aber auch noch alternativ eine Starvis1-Kamera da, mit IMX183. Der IMX174 funktioniert aber noch ganz gut, bei 365nm. Na mal schauen.         

Lg Tino

[Nochnmikroskop]

Hallo Tino,

Du könntest mal versuchen einen Schmetterlingsflügen abzulichten. Da sind in den Schuppen kleine Unterteilungen erkennbar, das sollte das Objektiv eigentlich schon ordentlich auflösen können.

Meiner Meinung nach ist übrigens die 4500 LP/mm nicht aufgelöst, ich würde hier 4000 LP/mm als gut aufgelöst bezeichnen. 
Bild 7 finde (DIC2) ich schon recht beeindruckend, ist aber nicht gestackt, oder?

Was für einen Arbeitsabstand hat das 150x?

LG Frank

[TStein]

Hallo Frank,

zum Arbeitsabstand dieses speziellen Objektivs hab ich leider nichts gefunden. Ich gehe aber davon aus, dass der Abstand den anderen 150x/0.90 Fluotaren entspricht, also so etwa 0,2-0,25mm.
Die oben dargestellten Bilder sind übrigens keine Stacks, sondern unbearbeitete Rohbilder der Kamera mit Gamma=1.0.

Bezüglich Schmetterlingsschuppen habe ich mich umgesehen und in einer Fensterbank ein totes Tagpfauenauge gefunden. Zur Abbildung der Schuppen habe ich kurzerhand mal das Fokusstacking ausprobiert, da die Schärfentiefe schon ziemlich begrenzt ist.
Hab diesbezüglich PICOLAY getestet, bin aber dann doch zu FUJI/ImageJ gewechselt. Da kann man die Berechnungen extrem schnell mittels CLIJ2 auf der Grafikkarte laufen lassen, so etwa Faktor 10 schneller als PICOLAY (also eher einige 10er Sekunden, statt Minuten). Trotzdem ist PICOLAY klasse, da die Übergangszonen und Fehlstellen, an welchen die 3d-Rekonstruktion versagt, besser gefüllt werden.

So aber nun ein paar Bilder, erstmal die normalen Leica Auflichtobjektive bei 365nm Wellenlänge:

Bild 1: Helle Schuppe, UV365nm PL Fluotar 50x/0.80 Sobel-Fokusstacking, Bild 2: Clahe kontrastoptimiert


Bild 3: Helle Schuppe, UV365nm PL Fluotar 100x/0.90 Sobel-Fokusstacking, Bild 4: Clahe kontrastoptimiert


Fortsetzung folgt.
     

[TStein]

Weiter gehts mit den spezial UV-Objektivaufnahmen:

Bild 5: Helle Schuppe, UV365nm UV150x/0.90 Sobel-Fokusstacking, Bild 6: Clahe kontrastoptimiert


Bild 7: Helle Schuppe, X-Pol (gekreuzte Polarisatoren) UV365nm UV150x/0.90 Sobel-Fokusstacking, Bild 8: Clahe kontrastoptimiert


Die Querbalken kommen denke ich ziemlich gut raus. Mit X-Pol ist der Kontrast nochmal besser, aber die Belichtungszeit ist bedeutend länger, bzw. es muss die Verstärkung der Kamera entsprechend erhöht werden.

Lg Tino
Ps. Falls sich jemand die originalen Fokusstack-Videos anschauen möchte, kann ich diese gerne auf mein Google-Laufwerk legen, sind leider zu groß füs Forum.

[peter-h]

Bei meinen ersten Versuchen mit UV habe ich auch eine Schuppe des Kohlweisslings aufgenommen. Leider habe ich nur noch wenige Daten zur Aufnahme. Leitz Apo 90/1,4 Öl, LED @ 365nm, monochrome Kamera.


Peter

[Nochnmikroskop]

Hallo Tino,

das sieht ja schon ganz gut aus, allerdings wenn man dann das von Peter angefügte Bild des Kohlweißlings vergleicht .... 

Hallo Peter, 

tolle Auflösung, ich glaube mehr geht dann wirklich nicht mehr, NA1,4 mit 365nm. Kommt ja schon an so manches REM Bild heran. Wenn ich das einigermaßen richtig vermessen habe, sind die Schuppen ähnlich der des Tagpfauenauges, Vgl. meine Messungen.

Anlage Schuppe Tagpfauenauge mit Maßen, normales LED Durchlicht

LG Frank

[TStein]

Hallo Peter,

ich hatte schon gesehen, dass du ziemlich viel Richtung UV-Mikroskpie gemacht hast. Die Kohlweißlingschuppe ist prima aufgelöst. Mit Immersion und einer NA=1.40 geht anscheinend noch ein bisschen mehr. Die Kohlweißlingschuppe ist aber strukturell doch etwas spezieller, zumindest die weißen Schuppen.
Auf die Schnelle habe ich dies gefunden:
https://www.researchgate.net/figure/SEMs-of-scales-of-the-small-white-Pieris-rapae-a-A-white-scale-The-ridges-have-only_fig2_8405587
Da hängen an den Querrippen anscheinend noch "Minibälle", wie auf deiner Aufnahme denke ich schon gut zu sehen.
Die Tagpfauenaugenschuppe ist da eher unspektakulär, also nur Querrippen bei den Weißen. Ich werde mich mal nach einem Kohlweißling umschauen, vllt. lassen sich die Strukturen dann besser vergleichen. Die Kamera rauscht auch schon etwas deutlicher im UV, sodass eine längere Belichtungszeit oder eine gestackte Bildeserie für die Auflösung sicherlich noch zuträglich wäre. 
Ich hätte übrigens auch noch ein HCX Pl Apo 63x/1.4 und ein HCX Pl Apo 40x/1.25 da und könnte damit auch nochmal testen. Mit was hast du denn damals Immergiert, falls sich es noch nachzuvollziehen lässt? Funktionieren dann die normalen Immersionsöle bei 365nm noch, ohne selbst zu fluoreszieren, oder sind spezielle erforderlich?
Hallo Frank, auch eine gute Aufnahme. Kannst du sagen, ob das eine helle, dunkle oder farbige Schuppe war? Ich kann ja auch mal bei mir nachmessen.   

Lg Tino

[TStein]

Hab nochmal fix einen Ausschnitt vergößert (+ etwas entrauscht) und nachgemessen.




Bei mir (Pixelskalierung 38,4nm/Pixel) haben die Längsrippen eher 1,7µm Abstand, die Querrippen 0,6µm, also etwas kleiner, als bei dir, Frank. Vllt liegt es ja an der Färbung, bzw am Typ der Schuppen, meine sind auch eher gerundet und nicht so zackig. Hab auch dunkle Schuppen aufgenommen, aber noch nicht ausgewertet.

Lg Tino

[Nochnmikroskop]

Hallo Tino,

die gemessene Schuppe war dunkelbraun. 

Ich habe nochmal eine helle Schuppe angesehen, die hat ebenfalls, wie Deine gezeigte, runde Kanten und weist Längsstrukturen von fast exakt 1,7µm auf, Du hast also richtig interpoliert. 
Die hellen Schuppen sind also noch etwas feiner strukturiert, um so respektabler die Auflösung, die Du bereits erreicht hast.

LG Frank

[TStein]

Hallo nochmal,

um den Vergleich abzuschließen, habe ich heute nochmal meine Immersionsobjektive zum Vergleich im VIS und UV@365nm getestet.

1. HCX PL Apo 40x/1.25-0.75 Oil VIS


2. HCX PL Apo 40x/1.25-0.75 Oil UV365nm


3. HCX PL Apo 63x/1.4-0.7 Oil Lbd.Bl VIS


4. HCX PL Apo 63x/1.4-0.7 Oil Lbd.Bl UV365nm


5. Und nochmal zum Vergleich das spezielle UV Objektiv 150x/0.90 365nm


Das HCX Pl Apo 40x/1.25-0.75 Oil fällt im Vergleich sehr deutlich ab, auch im VIS. Die Blende war übrigens offen, hab ich kontrolliert. Da muss ich nochmal schauen, ob mit dem Objektiv soweit alles ok ist.
Das HCX PL Apo 63x/1.4-0.7 Oil Lbd.Bl Immersionsobjektiv, welches nochmal speziell für blaue Fluoreszenz optimiert ist, erreicht die Auflösung des UV-Trockenobjektivs @365nm bereits im VIS. Ist auch im Grunde so zu erwarten. Im UV bei 365nm steigt die Auflösung noch etwas, sodass hier die 4500Lp/mm deutlicher aufgelöst ist, als beim speziellen UV-Objektiv. Mit Immersion geht also im UV auch noch etwas mehr. Was aber trotzdem festzustellen ist, ist dass das UV-Objektiv kontrastmäßig im UV doch ziemlich weit vorne liegt. Ich denke da lässt die Korrektur der VIS-optimierten Apos doch etwas nach, die Abbildung im VIS ist da bedeutend knackiger.
Interessant wäre, ob die neueste Generation der Leica Öl-Apos (U-V-I) im UV@365nm noch etwas besser performen.

Alle Bilder sind übrigens ungestackt und ohne Kontrastoptimierung/Gamma, also direkt aus der Kamera. Und nur Auflicht, bevor ich es vergesse.

Lg Tino