Altes Leitz Ploemopak richten

[Jürgen H.]

Hallo Andreas,

Welche Objektive verwendest du? Hast du eine Bertrand-Linse im System, damit du auf Verunreinigungen checken kannst?

Verwendet habe ich ein 25/65er PlApo.Bertrand habe ich nicht, allerdings ein Einstellfernrohr.
Ich bin gespannt auf Dein Fluoreszenzbild. Bei mir führt eine einfache Durchlichtfluoreszenz mit dem BG 38 auf dem Lichtaustritt ohne den Ploemopak zu schärferen Bildern...

Viele Grüße

Jürgen

[andr_brno]

Hallo Jürgen,
ich habe dich nicht vergessen. Aaaber - die Floureszenz des Chlorophylls kann ich nicht ordentlich fotografieren. Ich hänge dir zwei Bilder an, ein Moosblättchen mit 22er Wasserimmersion im Durchlicht, Filterwürfelstellungen 1 (UV), die Chloroplasten sind scharf. Das sieht auch mit Filter 4 relativ gut aus (halt recht rot in rot), obwohl er "wolkig" gealtert ist, wie du weißt. Dann der Versuch mit Auflicht blau, mit oder ohne blauem Anregungsfilter (ist bei der blauen LED egal), Filterwürfel 4. Optisch kann ich Strukturen in den Chloroplasten erkennen, die Begrenzung ist scharf, der Hintergrund schwarz.
Die Kamera macht mit einer Belichtungszeit von rund 1 sec unscharfe rote Flecken vor rötlichem Hintergrund draus.
Mehr kann ich mit meinen technischen Mitteln nicht herausholen - vielleicht ginge was mit Justage von ASA-Werten und manueller Vorgabe der Belichtungszeit. Dazu fehlt mir die Muße.
Schwierig ist auch der Effekt, dass die beleuchteten Chlorplasten schnell "ausbleichen" - bis man an der Kamera herumgefummelt hat, ist die ganze Pracht schon verblasst.
Ich kann dir gerne per Mail noch weitere Ergebnisse zum Veergleich schicken, sende mir gerne eine Nachricht.
Grüße
Andreas

[Jürgen H.]

Lieber Andreas, herzlichen Dank für Deine beiden Bilder. ich möchte vermuten, dass Du nicht nur eine Belichtungszeit von 1 Sekunde, sondern auch eine recht hohe Isozahl verwendet hast? Bei meinem Ploemopak bekomme ich kaum ein fotographierfähiges Bild heraus, es ist einfach sehr lichtschwach. Zeigen kann ich nur eine Alternative: Foto mit Ortholux, Durchlicht, Glaserregerfilter BG 12 4 mm, Weißlicht LED, Sperrfilter K 530, Pl APO 170/25, Fluokondensor 1,4 mit Wasser emergiert, Coolpix 4500, Belichtung 1/2 Sek.,  ohne Weißabgleich vor der Photographie. Präparat Niere, 2mü, H-E Färbung.

Die Mängel sind unverkennbar. Zum Teil sind sie auf mangelnde Fähigkeiten zurückzuführen. Die Coolpix bereitet mir enorme Schwierigkeiten, das Präparat wirklich scharf zu stellen. So ist auch bei mir der visuelle Eindruck weitaus besser. Aber der Versuch genügt, um für mich die Schlussfolgerung zu ziehen, dass in meinem Fall die Durchlichtlösung vorzugswürdig ist, die Mühe, den Ploemopak zu richten, scheint sich nicht zu lohnen. Es mag auch an der Beleuchtung liegen, die bei mir ja "über zwei Ecken" sprich Spiegel erfolgt -ich habe ja noch das Umschaltortholux...

Viele Grüße

Jürgen

[Jürgen H.]

Ergänzung: Das Hellfeldbild habe ich mit dem gleichen immegrierten Fluokondensor ohne Abblendung und ohne Leuchtfeldblende aufgenommen. Das sähe mit dem Berek anders aus.

[purkinje]

Hallo Jürgen,
meinst Du mit dem "Fluokondensor" den hier: Kondensor 72r? Falls ja, glaube ich nicht dass ein Berek mit Immersionskappe ran kommen würde.
Beste Grüße Stefan

[Jürgen H.]

Lieber Stefan, ja der 72r, ein Kondensator mit 1,4 Ap.ohne Leuchtfeldblende, insoweit anders als beim Berek.
Zum Vergleich zwei Aufnahmen mit dem Derek 1,4, Glyc Immersion, Bel. 1/2 Sek beim Fluobild, sonst im Wesentlichen ähnliche Bedingungen, gleich sind sie ja nie.Das Fluobild ist vollständig unbearbeitet, nur etwas verkleinert.

Viele Grüße

Jürgen

[Spectrum]

Hallo Jürgen,
Wie sieht denn ein Bild des HE Schittes in Auflichtfluoresz mit deinem Ploemopak aus?
Das Bild des Moosblättchens sah ja zumindest was den schwarzen Hintergrund angeht, gar nicht mal so schlecht aus.
Aber hier kommen ja doch einige Variablen gleichzeitig ins Spiel (verschiedene Lichtquellen, Präparate, verschiedene Emissionsfilter...)
Da fällt ein Vergleich erstmal schwer.
LG Holger

[Jürgen H.]

Lieber Holger,

anbei noch zwei Bilder: Wesentlich besser wird der Kontrast über einen schwarzen Hintergrund, wenn das Spektrum des Erregerlichtes weiter eingeschränkt wird, indem ich mit einer 470nm LED beleuchte: Das erste der beiden folgenden völlig unbearbeiteten Bilder zeigt das Nierenpräparat mit Durchlichtfluoreszenz! - über den Berek 1,4 Glyc. aber durch den Teilerspiegel des Ploemopak, den Sperrfilter des Ploemopak und den K530.

Hingegen ist die Auflichtfluoreszenz über den Auflichtstrahlengang viel zu lichtschwach. Bei diesem Versuch habe ich den BG 12 4 mm einfach in den Auflichtstrahlengang gehalten. Der ist hierfür eventuell etwas zu dick. Ohne den BG 12 geht es aber gar nicht: Dann bekomme ich ein absolut vergrüntes Bild.

Viele Grüße

Jürgen

[Spectrum]

Hallo Jürgen,
Ok,
In Bild Nr.1 sehen wir ein Bild im Durchlicht, mit der blauen LED als Beleuchtung (das sieht ja schonmal ganz gut aus).
Hier sieht man auch den Vorteil gegenüber deiner Aufnahme mit weißer LED. Der Hintergrund ist aufgrund des viel "sauberen" Anregungslichts viel dunkler, in Relation zu dem Fluochrom.

Bild Nr.2 ist genau mit derselben Konstellation, aber diesmal über den Auflichtstrahlengang des Ploemopak beleuchtet, richtig?
Und bei zweiterem hast du massive "Vergrünung", auch über dem ansonsten bei Durchlicht dunklem Hintergrundbild...
Und das Grün verschwindet dann nur mit dem BG12?

Wo kommt dieser Grünschleier der nur bei Auflicht so deutlich auftritt, her?

Das sieht mir nach irgendeiner ungewollten Fluoreszenz oder Sreulicht im Auflichtstrahlengang aus, die nur bei Beleuchtung von oben auftritt.

Ist der Grünschleier auch noch zu sehen wenn du den Objekträger und den Kondensor entfernst, bzw. einfach nur ein schwarzes Stück Papier zwischen Kondensor und Objekttisch hälst?
Wenn das auch nichts an der Situation ändert muss das Problem im Ploemopak selbst liegen.
Und zwar auf der Strecke des Anregungslichts zwischen LED und Objekt.
LG Holger

[Jürgen H.]

Wo kommt dieser Grünschleier der nur bei Auflicht so deutlich auftritt, her?

Lieber Holger, das ist ein Missverständnis. Die ,,Vergrünung" träte auch bei der Durchlichtfluo auf, wenn ich den BG 12 weglassen und nur mit der 470 nm LED beleuchten würde. Die Erklärung wird einfach sein: Sperrfilter und Erregerfilter müssen gut abgestimmt sein. Der Leitzsche K 530, der ich bei der obigen Durchlichtkonstruktion verwendet habe, ist eigentlich nicht der passende Sperrfilter. Der dient ja nur dazu, restliches Erregerlicht abzuschirmen. Der eigentliche Sperrfilter wäre ja laut der Leitzschen Ploemopakschrift ein K495, setzt also erheblich früher an. Der ist daher im Ploemopak als Sperrfilter verbaut.Und der K530 kommt zusätzlich.  Siehe hier: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=38925.0

Auf Erregerseite wird andrerseits die 470er LED ein breites Spektrum aufweisen. Das dürfte wohl durch den BG12 verengt werden.

Herzlichen Gruß

Jürgen

[K. B.]

Hallo Jürgen,

die älteren Anregungsfilter(farbiges Glas) sind häufig sehr schlecht was die Lichtausbeute angeht, ich habe an meiner Olympus BH2 RFCA einen Adapter für die alten Zeiss Filter(IV FL) und deshalb auch mal direkt vergleichen können.

Die modernen "Spiegelfilter", die nicht benötigte Wellenlängen einfach zurückwerfen und selbst kaum einen Millimeter dick sind, lassen extrem viel Licht durch so das man das Fluoreszenzlicht schon mit bloßem Auge sehr gut betrachten kann.
Die alten teils 5mm dicken Filter lassen so wenig Licht durch, das man bei gleicher Beleuchtung kaum etwas erahnen kann.
Hab bei meinem Zeiss daher angefangen die Anregungsfilter durch neuere zu ersetzen immer wenn ich passende im Handel finde.
Wirklich gut sind die klassischen Filter meiner Meinung nach nur in Kombination mit einer Kamera.

Viele Grüße
Kay

[Spectrum]

Alles klar.
Die zwei letzten Bilder sind also bis auf die Beleuchtungsrichtung (einmal Durchlicht und einmal Auflicht durch den Ploemopak) ansonsten unter völlig gleichen Bedingungen aufgenommen worden.
(Ich geh davon aus, dass Iso und Belichtungszeit gleich waren)
Dann sind die beiden Bilder vergleichbar und es lassen sich folgende Dinge feststellen:
1.Deine blaue LED enthält immer noch soviel Anteile im Grünbereich, dass diese den Hintergrund deiner Aufnahmen ohne den BG 12 "vergrünen". Viel weniger als bei deiner Weißlicht-LED, aber immer noch deutlich.
2.Auch wenn die Aperturen des Durchlicht und des Auflichtkondensors nicht identisch sind und zwei verschiedene Beleuchtungsrichtungen vorliegen, (soviel zu Äpfel und Birnen), kommt mir das Ausleuchtung mit dem Ploemopak *viel* zu dunkel vor.
Und so wie es ausschaut auch nicht symmetrisch. Das Bild ist doch oben rechts deutlich heller.
Wie bereits weiter oben beschrieben hängt das wohl mit einem immer noch massiv dejustierten Teilerspiegel zusammen. Das Objektiv das ja auch gleichzeitig als Kondensor fungiert wird nicht richtig ausgeleuchtet.
Ändert sich dieser Lichtfleck, wenn du das Stellrad einen Tick verstellst?
Achja, und was die Filter an sich angeht, natürlich gibt es da einen gewaltigen Qualitätsunterschied zwischen den alten Glas- oder Gelantinefiltern, aber das alleine erklärt die schlechten Ergebnisse des Ploemopak nicht. Sofern man den Hintergrund schwarz hinbekommt ist man ach mit Glasfiltern gut bedient. Zumindest wenn es um Anregungsfilter geht. Eine *geeignete* Farb LED macht da mit ihrem schmalen Spektrum und der großen Leistungsreserve bei den üblichen Anwendungen einiges wett.
Ich hab dazu mal eine Vergleichsreihe hier gepostet wo man den Vergleich sieht:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=49937.0
Der Einfluss des K530er Filters anstatt des K495, spielt für das Ergebnis auch eine gewisse Rolle und macht das Bild zusätzlich etwas dunkler, aber ist nicht der Grund für das schlechte Ergebniss des Auflichtkondensors.

Lange Rede kurzer Sinn, du wirst nicht drumherum kommen irgendwie die Teilerspiegel wieder richtig zu justieren.

Grüße Holger

[Jürgen H.]

Lieber Holger,
Danke für Deine vielen Überlegungen. Ja, ich kann den Lichtfleck etwas mehr zentrieren, indem ich an dem Stellrad leicht drehe. Die Stellkonstruktion ist im Inneren recht simpel aufgebaut: Auf der Unterseite der Drehscheibe, auf der die Filter befestigt sind, befinden sich vier Halbkugelpaare. Die beiden Halbkugeln jedes Paars stehen dicht beieinander. Zwischen sie kommt ein Stängchen zu liegen, wenn das Drehkurussel in eine der vier Fluostellungen einrastet. Und dieses Stängchen kann man ein wenig verstellen. Hab ich bereits einmal versucht: Bisher lag der Lichtfleck der Beleuchtung zu weit nach links, jetzt liegt er zu weit nach rechts. Von der Gesamtdrehung des Karussells von 360 Grad macht die Differenz ja nur etwa ein Grad aus, ist halt schwierig, das exakt hinzubekommen. In irgendwelchen Winterstunden werde ich eventuell nochmal einen Versuch starten.
Was mich allerdings zusätzlich wundert, ist, dass der Lichtfleck der Beleuchtung im Objektiv relativ klein erscheint. Selbst wenn er vollständig zentriert wäre, würde er auf ca 2/3 des Blickfelds begrenzt sein.

Zusätzlich müsste ich noch einen Anregungsfilter für die Blaulichtanregung beschaffen. Den hat ein Vorgänger von mir im Besitz dieses Teils ja entnommen.

Gleiches gilt für eine bessere Lichtausbeute, wenn ich bei der Durchlichtfluo bleiben würde. Hier kommt Deine Bemerkung Kay, ins Spiel: Welchen Interferenzfilter hast  Du denn für die Blauanregung versucht? Woher beziehst Du Deine Interferenzfilter? Gerne auch als PN...

Wobei mein letzter Versuch der Durchlichtfluo gar nicht so schlecht aussieht. Das angehängte Bild ist wieder vollständig unbearbeitet, Belichtungszeit 1/2 Sekunde, etwas optimierter Strahlengang, aber ohne Ploemopak. Allerdings beträgt die Schnittdicke des Präp. ja nur 2mü. Bei z.B. einem dickeren Pflanzenschnitt hätte eine Auflichtfluo gegenüber der Durchlichtfluo noch mehr Vorteile.

Viele Grüße

Jürgen

[junio]

Hallo Jürgen,

BG12-Filter werden nicht mehr hergestellt und wurden durch BG25-Filter ersetzt, die im Anregungsbereich eine höhere Transmission haben.
Im Internet findet Du bei Schott oder  pgo-online.com  einen Rechner, der die Transmissionsunterschiede nach Filterdicke aufzeigt.

Zu passenden Interferenzfiltern kann evtl. Kay etwas sagen.

Beste Grüße von Jürgen

[Spectrum]

Hallo Jürgen:
Bei chinesischen Herstellern kannst du für einen überschaubaren Preis einen Kurzpassfilter mit 490nm cutoff Wellenlänge bestellen. (Ich schick dir mal eine PN wo genau).
Die Vorteile eines Kurzpassfilters wären:
Der lässt, wie Kay schon geschrieben hat, viel mehr Licht durch als dein BG12 und eliminiert die grünen Restanteile der LED sehr gut. Da er ein Kurzpassfilter ist hast du damit auch das "universellste" weil am breitesten aufgestellte und helltste Anregungslicht. Damit kannst du gut mit Acridinorange und der Autofluoreszenz von Chlorophyll arbeiten. Von Zeiss Jena gab es für das Jenalumar auch vergleichbare Filter. Die sind mit Kp470 gekennzeichnet. Damit wurden die Vergleichsaufnahmen in meinem verlinkten Faden gemacht.
Nachteil: Den Daten nach lässt der chinesische Filter auch alle UV Anteile durch, der Zeiss Jena Filter ab 360nm. Das kann Probleme mit Autofluoreszenz bestimmter Verkittungen/Immersionsölen oder Einbettungsmedien machen. Inwieweit hängt dann auch wieder von den Eigenschaften deiner LED ab.
Die unerwünschten UV Anteile kann man aber auch mit einem einfachen UV-Schutzfilter herausfiltern.

Breitbandinterferenzfilter in dem Bereich gibt es auch. Die findet man gelegentlich in der Bucht. Zeiss hat z.b. einen 450-490 Bandpassfilter in seinem Filtersatz 09 verbaut. Es gibt sie in zahlreichen spezifischen Bandbreiten und unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. 
Vorteile:
Die unterdrücken auch Wellenlängen unterhalb einer bestimmten Wellenlänge.
Nachteile: Durch das eingeengte Anregungslicht wird das Bild insgesamt dunkler. Ausserdem werden durch diese Filter bevorzugt die Fluochrome angeregt, auf die das Anregungsband am besten passt. Das will man aber als Amateur, der gerne viel auf dem Bild sehen will, aber gar nicht unbedingt.

Mit Gelfiltern wirst du, glaube ich, nicht glücklich werden.

Aber erstmal würde ich schauen, ob dein Ploemopak überhaupt noch zu retten ist, ohne eine Justierung der Teilerspiegel wird das nichts.