Zieralge einmal anders aufgenommen

[reblaus]

Hallo Rudolf -

wenn sich jemand als Fachmann outet, muss er damit rechnen zu Rate gezogen zu werden -
hier mein Problem:

Ich habe einige seeeehr alte REM-Fotos von Mehltau infizierter Blattepidermis. Zum Teil Gefrierbrüche, die den seitlichen Einblick in Epidermiszellen erlauben.
    Leider sind meine Unterlagen bei einem Umzug ins Nirwana verschwunden und ich weiß ich nicht mehr wie wir die damals genau hergestellt haben, nachdem sich die kritische Punkt Trocknung als recht umständlich erwiesen hatte.

Ich weiß nur noch, dass im Labor reichlich flüssiger Stickstoff im Thermosgefäß vorhanden war, außerdem auch Trockeneis. Meiner Erinnerung nach hatten wir die Blattstücke auf den Alutellerchen für das REM fixiert. Dann haben wir Propan irgendwie tiefgekühlt um es in Schlicker zu verwandeln. Damit wurden dann die Tellerchen mit den Blattstücken tiefgefrostet (??).
In diesem Zustand wurden sie dann ins REM eingesetzt und darin durch Evakuieren "gefriergetrocknet". Der Vakuumpumpe scheint das nicht geschadet zu haben.

Könntest Du mir hier Tips geben, die vielleicht meiner Erinnerung auf die Sprünge helfen und eine geistige Verbindung zu KPT herstellen könnten?

Viele Grüße

Rolf

[rlu]

Hallo Rolf,

du beschreibst ja schon in Ansätzen, wie du das mit dem Kyrobruch gemacht hast.
Ich kenne jemanden im Verein, der ein REM im Keller stehen hat. Der wollte immer CPD/KPT machen. Konnte mir auch nicht so richtig erklären wie das funktioniert und ich bin auch sonst nicht so richtig drauf gekommen.
Die Erklärung zum Thema KPT scheint mir schlüssig.

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=388318

RLU: "wie könnte man jetzt einen Kyrobruch erzeugen, damit man die inneren Strukturen, Aufbau erkennen kann?"

Ich kann Dir da nicht weiterhelfen. Finde das Thema mit den Kyrobrüchen sehr interessant, weil es den Blick in die Zelle erlaubt. Die Frage ist ja jetzt, ob du die KPT vorher angewandt hast. Oder vielleicht hat man das Restwasser zum Auf-Sprengen benötigt?

Da schließt sich auch die nächste Frage an, warum man nicht immer auch zusätzlich "sprengt", man will die Gebilde doch auch von innen sehen?

Liebe Grüße
Rudolf

[Rene]

Hi Rolf, my two cents:

Freezing in liquid N2 is inefficient due to the insulating layer of boiling gas around the specimen. Better is to freeze in N2 slush, which is colder than N2 at boiling point. Liquid propane can be used as it cools your specimen a lot quicker than nitrogen. The propane is kept in liquid state with liquid nitrogen (au bain marie ;-).

SEM specimen can be imaged in frozen hydrated condition on a (cold) cryostage in the SEM, or freezedried in a vacuum (sublimation of the internal water from ice to gass).
The specimen can be broken to expose internal structures in the SEM, before or after freezedrying, but it needs drying before imaging in the SEM, otherwise you will be looking at a solid chunk of water in the specimen.

The frozen specimen can also be cut in a cryotome ('shaved') to expose the internal cel architecture on organelle level. The shaved surface was then shadowed with a layer of carbon on a cold stage in a carbon evaporator. The resulting replica surface was imaged on the TEM (at least in the 90's). This is far more critical than traditional SEM viewing, as it needs very quick freezing (vitrification) in order to avoid freeze artefacts by ice-crystals. It worked for only a couple of cell layers thick.
At the time ('90's) there was a lot of interest in the membrane surfaces of organelles.

Best, René

[Marcus_S]

Hallo Rolf,

Ich weiß nur noch, dass im Labor reichlich flüssiger Stickstoff im Thermosgefäß vorhanden war, außerdem auch Trockeneis. Meiner Erinnerung nach hatten wir die Blattstücke auf den Alutellerchen für das REM fixiert. Dann haben wir Propan irgendwie tiefgekühlt um es in Schlicker zu verwandeln. Damit wurden dann die Tellerchen mit den Blattstücken tiefgefrostet (??).
In diesem Zustand wurden sie dann ins REM eingesetzt und darin durch Evakuieren "gefriergetrocknet". Der Vakuumpumpe scheint das nicht geschadet zu haben.

Es gibt zu dem Thema Berufenere als mich. Aber ich erinnere mich noch dunkel an das, was mir damals mein Chef lang und ausführlich erklärt hat (ich habe aber nie selber elektronenmikroskopiert), das kann ich ja mal zum Besten geben:

Wirft man Blattschnipsel oder so in Flüssigstickstoff, so ist das wohl eine sehr zuverlässige Methode, mikrometergroße Eiskristalle , die unschöne Artefakte erzeugen, zu bilden. Daher wirft man die Probe in mit Flüssigstickstoff tiefgekühltes Propan, weil damit höhere Abkühlraten erzielbar sind (Propan zeigt kein Leidenfrostsches Phänomen). Also gibt das keine Eiskristalle, wenn man das richtig macht.

Und dann muß man fix sein. Will man kein Eiskristallwachstum nach dem Einfrieren, so muß man (so damals mein Chef) die Probe dauernd, immerzu und ununterbrochen unter etwa -80 °C halten.

Oder man bricht die in einer Apparatur (damals war das ein Gerät von der Größe einer ausgewachsenen Anrichte) auf (Gefrierbruch), läßt ggf. im Vakuum ein wenig von dem Eis absublimieren (Gefrierätzung), bedampft/besputtert die Probe und mikroskopiert dann - zumindest für klassisches TEM - den abgelösten Abdruck (Platin-Kohle-Schrägbedampfung mit Kohle-Stützschicht).

Bis zum Schritt Gefrierätzung muß bei TEM und (klassischem) REM, (also nicht "schlecht-Vakuum"-REM) eigentlich alles gleich sein.

Hilft Das irgendwie bei den Erinnerungen?

Viele Grüße von Marcus



Ich sehe gerade, ich war zu langsam...

[Wolfgang Bettighofer]

Lieber Wolfgang,

nach längerer Zeit habe ich hier ins Forum mal reingeschaut und bin gerade über deinen tollen Beitrag gestolpert.
Ich kann auch den REM Meistern ihres Faches auch nicht das Wasser reichen wollte aber, weil passend zum Thema HDMS und CPT ist, unterschiedliche Ergebnisse aufzeigen, die mit HDMS auftreten können.

Alle drei Zieralgen wurden gemeinsam in einer Charge entwässert und zeigen trotz dem unterschiedliche Ergebnisse.
Ich schätze mal, dass hier der Austausch von Restwasser / Alkohol / Azeton gegen HDMS nicht 100%ig war.
Meines Wissens nach verzeiht die CPT diesbezüglich solche Fehler, da das Verhältnis CO2 zum Restalk. bzw. Azeton viel größer ist und HDMS gegenüber CO2 am kritischen Punkt halt eine Flüssigkeit ist.

LG
Bernd

Lieber Bernd,

vielen Dank für die Info! Und, ja, sehr schöne REMs, perfekt aufgestellt! 
Wir werden also zusehen, den Materialverlust bei den Einzellern in der KPD/CPD in den Griff zu bekommen, auch deswegen, weil eine KPD-Anlage vorhanden ist, die anderen "Reagentien" aber nicht

Nun heißt es aber eh erstmal warten, bis wir wieder in Tirols Mooren sind und neue Zieralgen geschöpft haben! Aktuell bin ich virtuell in den Mooren und bastle Bilder aus den Rohaufnahmen des vergangenen Jahres:



LG
Wolfgang