Auswaschen und Lagern von fixierten Proben

[rlu]

Hallo,

was meint die KI zum Auswaschen und Lagern in 70% Alkohol.
Das Thema Auswachen und Lagern von fixierten Proben wird meistens übersehen oder es kommt zu kurz.
Wäre interessant was andere drüber denken.


Wie und wie lange muss man fixiertes Material auswaschen?
Ziel: Das Auswaschen dient dazu, das Fixativ (meist Formaldehyd/Formalin) aus dem Gewebe zu entfernen. Fixativreste können spätere Färbungen stören, die Antigenität für Immunfärbungen beeinträchtigen oder im Laufe der Zeit das Gewebe weiter schädigen.

Wie:
Spülmedium: Verwenden Sie in der Regel Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) oder 0,9 %ige Kochsalzlösung (NaCl) . Bei reiner Routine-Histologie (nur H&E) ist oft auch fließendes Leitungswasser üblich, für empfindliche Nachweise (IHC, PCR, Elektronenmikroskopie) sollte jedoch gepufferte Lösung verwendet werden.

Methode: Das Gewebe sollte in einem ausreichend großen Volumen der Spülflüssigkeit liegen. Es ist wichtig, die Flüssigkeit regelmäßig zu wechseln (z. B. 3- bis 5-mal über den Waschzeitraum verteilt), um den Konzentrationsgradienten des Fixativs effektiv abzutransportieren. Bei Verwendung von PBS empfiehlt sich sanftes Schütteln (z. B. auf einem Schüttler).

Wie lange:
Die Dauer hängt von der Größe des Gewebes und der Fixierungsdauer ab. Als Faustregel gilt:

Kleine Biopsien (< 5 mm): 2–4 Stunden bei mehrfachem Wechsel des Waschpuffers.

Größeres Gewebe: 6–12 Stunden (über Nacht) bei kontinuierlichem Wechsel oder fließendem Wasser (falls Wasser verträglich).

Wichtig: Bei sehr langer Fixierung (z. B. über Wochen) muss entsprechend länger gewaschen werden. Wenn Sie das Gewebe nach dem Waschen in 70 % Ethanol überführen möchten (siehe Lagerung), reicht oft ein kurzes Waschen (30–60 min in PBS), da das Ethanol später das Fixativ ebenfalls auszieht.


Überfixierung
Unter Überfixierung versteht man, dass das Gewebe länger im Fixativ (meist Formalin) bleibt, als für die vollständige Durchfixierung nötig wäre (z. B. Tage oder Wochen statt Stunden).
A) Übermäßige Vernetzung (Crosslinking)
B) Erhöhte Brüchigkeit und Härte
C) Nukleinsäure-Degradation
D) Basophile Verfärbung

Zusammenfassende Empfehlung
Fixierung: Nicht länger als 24–48 Stunden (je nach Größe) in Formalin belassen.
Waschen: Nach Fixierung 2–4 Stunden in PBS (mehrfach wechseln) oder 30–60 Minuten unter fließendem Wasser.
Lagerung: Zur kurzfristigen Aufbewahrung (Tage/Wochen) in 70 % Ethanol oder in PBS mit Natriumazid bei 4 °C.
Langzeitlagerung: Am besten direkt nach der Fixierung in Paraffin einbetten oder als Gefrierschnitt (in OCT) bei -80 °C lagern.

PBS (Phosphatpuffer-Salzlösung) – ein pH-stabiler, isotoner Puffer, der das Gewebe in einem naturnahen Milieu hält.


Härtet 70 % Ethanol die Probe und verschlechtert die Schneidbarkeit?
Ja, das ist korrekt – aber mit Einschränkungen.

Mechanismus: Ethanol entzieht dem Gewebe Wasser und denaturiert Proteine teilweise. Dadurch wird das Gewebe fester, manchmal spröde.

Auswirkung auf die spätere Schneidbarkeit:

Bei kurzer Lagerung (Wochen bis wenige Monate) ist der Effekt in der Regel reversibel. Während der anschließenden Einbettung wird das Gewebe durch die steigenden Alkohol-Konzentrationen (bis 100 %) und Xylol/Intermedium weiter entwässert und schließlich mit Paraffin infiltriert. Ein gut eingebettetes, vorher in 70 % EtOH gelagertes Gewebe lässt sich meist einwandfrei schneiden.

Bei sehr langer Lagerung (Monate bis Jahre) in 70 % Ethanol kann das Gewebe übermäßig austrocknen und brüchig werden. Dies führt dann tatsächlich zu Rissen, Ausfransungen oder Vibrationen am Mikrotom.

Alternativ: Wenn Sie das Gewebe länger als 3–6 Monate lagern müssen, ohne es einzubetten, ist PBS + Natriumazid bei 4 °C die schonendere Methode, da es das Gewebe nicht weiter austrocknet oder härter macht. Allerdings müssen Sie hier strikt auf Keimfreiheit achten.

Fazit zur Härtung:
70 % Ethanol ist ein bewährter Kompromiss. Es verhindert Schimmelbildung (im Gegensatz zu reinem PBS) und bewahrt die Morphologie gut, macht das Gewebe aber fester. Für die allermeisten Routinezwecke (H&E, Immunhistochemie) ist das unproblematisch. Falls Sie später besonders empfindliche Antigene oder extrem dünne Schnitte (z. B. 1–2 µm) benötigen, ist die Lagerung in PBS + Azid (oder das sofortige Einbetten) vorzuziehen.


Liebe Grüße
Rudolf

[B.Neuhaus]

Lieber Rudolf,

es hängt immer davon ab, wie man die Proben weiter behandeln will. Sind Nachweisreaktionen geplant, darf die Fixierung nicht zu lange dauern (nur wenige Stunden bei Objekten um 1-2 mm), damit die Proteine nicht zu stark quervernetzt sind. Will man hingegen Proben für lange Zeit aufbewahren, muss die Probe mindestens 14 Tage in 4 % Formaldehyd (gerne gepuffert) verbleiben. Diesen Zusammenhang hat H. F. Steedman 1976 in seinem Buch "Zooplankton fixation and preservation" beschrieben (https://unesdoc.unesco.org/ark:/48223/pf0000018592). Außerdem empfehlenswert: J.A. Kiernan (2015) "Histological and histochemical methods", 5. Auflage (https://dokumen.pub/histological-and-histochemical-methods-theory-and-practice-5th-edition-9781907904776-1907904778.html). Beide Bücher enthalten Rezepte und erläutern die chemischen Mechanismen.

Nach der Fixierung in Formaldehyd werden Museumsproben (!) gewässert (Objekte 1-2 mm je 10 min, größere 30-60 min, evtl. mehrfacher Wechsel des Mediums einer Stufe) und in einer aufsteigenden Ethanolreihe entwässert (40 %, 60 %, 70 % 75 %). Zu hohe Alkoholkonzentrationen härten das Gewebe zu stark. Man kann biologisches Material auch Jahrzehnte lang in 4 % Formaldehyd lagern.

Die Aufbewahrung in Alkohol ist weniger gesundheitsschädlich als die in Formaldehyd, und der Schnaps greift die Deckel von Twist-Off-Gläsern auch weniger schnell und weniger stark an. Hier kommt also noch eine weitere Komponente hinzu, nämlich das Aufbewahrungsgefäß. Glasgefäße leiden nämlich stark unter Glaskorrosion durch Wassereinwirkung über Jahrzehnte. Das sieht man erst, wenn man die Gläser trocket. Dann erscheinen die Gläser stumpf, milchig-opak oder regenbogenfarben, vergleichbar wie zu häufiges Waschen von Trinkgläsern in der Spülmaschine. Die korrodierte Glasoberfläche ist stark reaktiv und kann empfindliche Proben bei direktem Kontakt schädigen.

Die von Deiner KI angegebenen Empfehlungen beziehen sich mehr auf Gewebe für Nachweisreaktionen. Dazu gibt es gerade in der Medizin sehr viel Literatur, und das spiegelt meines Erachtens auch der von Dir präsentierte Text wieder. Ich würde mich nie auf KI-generierte Inhalte verlassen, da man keine Literaturquellen hat und nicht erkennen kann, worauf genau sich der generierte Text bezieht; zumindest hast Du keine Literaturquellen angegeben. Ich würde mir immer den Einzelfall genau anschauen und die spezifischen Anforderungen, erst dann kann man sinnvoll die passende Literatur suchen und entscheiden, wie man Material fixiert und lagert. Meine Angaben basieren auf 30 Jahren Arbeit in einem naturkundlichen Museum, da sind die Anforderungen sicherlich anders als bei Nachweisreaktionen.

Die Literatur zu diesem Thema ist umfangreich, da kann man viel lesen, wenn man möchte  .

Viel Erfolg und beste Grüße
Birger

[Gerd Schmahl]

Hallo Rudolf,
es ist sicher auch noch ein Unterschied, ob es pflanzliches oder tierisches Material ist. Du schreibst leider nicht, um welche Art von Proben es geht.
LG Gerd

[rlu]

Hallo Gerd,

eigentlich geht es mir hauptsächlich um tierisches Material.
Die Vernetzung ist ein ganz wesentlicher Punkt, um die Strukturen richtig darzustellen.
Ich bin auch begeistert von den Tiefenstrukturen, die man in 3D besonders gut erkennen kann.


Bei Pflanzen wird AFE verwendet. Irgendwie war das Thema "Auswaschen" dort nie so richtig ein Thema?
Außerdem bitte korrigieren. Kann man die Pflanzen-Probe unbegrenzt in AFE(Alkohol-Formaldehyd-Eisessig) liegen lassen?
Oft sind ja nur noch die Zellwände der Pflanzenzellen vorhanden. Woran liegt das eigentlich, werden die Zellen alle mit Chlorix behandelt und "entkernt"?
AFE; Alkohol-Formol-Eisessig.

Kannst du jetzt genaueres zum Auswaschen und zu den Lager-Zeiten sagen?
Vielleicht nimmst du auch andere Fixiermittel?

Liebe Grüße
Rudolf

[rlu]

Hallo Birger,

vielen Dank für die Antwort.
Am Anfang möchte ich eigentlich keine histochemische Nachweisreaktionen machen. Ich wäre froh, wenn es eine gute Färbung wird. Die dann auch lange Farbe und Struktur erhält. Also suche ich nach einer praxisgerechten Lösung. Ziel ist es tierische Proben z.B die Innereien einer Forelle, einen Regenwurm, einen Mehlwurm oder eine Schnecke zu schneiden.

Will man hingegen Proben für lange Zeit aufbewahren, muss die Probe mindestens 14 Tage in 4 % Formaldehyd (gerne gepuffert) verbleiben.

D.h. jetzt was genau? Wenn ich die Proben in Alkohol lagern will, dann sollten sie zuvor 14 Tage in 4% Formaldehyd = Formol gelagert werden?

Wie sollte man dann den Alkohol/Spiritus verdünnen, sollte man ihn überhaupt verdünnen?


Du schreibst:

Nach der Fixierung in Formaldehyd werden Museumsproben (!) gewässert

Werden andere Proben, für Nachweisreaktion, dann nicht gewässert, weil du das ausdrücklich betonst?

Liebe Grüße
Rudolf

[B.Neuhaus]

Lieber Rudolf,

man kann Gewebe auch in Ethanol abtöten, das geschieht dann durch Koagulation der Eiweiße. Der Mechanismus bei Formaldehydfixierung ist ein völlig anderer, hier werden Proteine miteinander vernetzt, was meiner Erfahrung nach zu einer besseren Strukturerhaltung führt und eine gewisse Zeit benötigt, daher die Fixierung für mindestens 14 Tage. Diese und andere Mechanismen werden insbesondere bei dem zuvor erwähnten Buch von Kiernan beschrieben, das man sich herunterladen kann. Dort wird auch erwähnt, welche Fixierungen mit bestimmten Färbungen nicht kompatibel sind. Die 22 Seiten lohnen sich wirklich zu lesen.

Man kann Proben in 4 % Formaldehyd lagern oder anschließend in ca. 75 % Ethanol überführen. Das Formaldehydfixativ wird man bei Lagerung in Alkohol los werden wollen und die Probe daher wässern. Möglicherweise kommt es andernfalls zu Reaktionen mit dem Aldehyd beim Färben. Aus Gesundheitsgründen will man das Formaldehyd ebenfalls ungern in der Probe haben. Bei anderen Fixierungen reicht eventuell ein Waschen mit Puffer, das hängt von der geplanten Weiterverarbeitung ab, da muss man die Rezepturen zu befragen.

Es ist auch wichtig, destilliertes Wasser für Fixierungen und Färbungen zu verwenden und kein demineralisiertes Wasser. Auch hier kommt man nicht darum herum, entsprechende Färbevorschriften zu Rate zu ziehen. Ethanol gibt es meist als 95 %ige Lösung zu kaufen, hier muss man mit destilliertem Wasser entsprechend verdünnen, um auf die niedrigeren Konzentrationsstufen zu kommen. Man muss nicht exakt z. B. 40 % Alkohol erreichen sondern kann problemlos um ein paar Prozent abweichen.

Falls Du es nicht kennst, von Chroma, heute Waldeck, gibt es eine Broschüre aus dem Jahr 2003 "Ausgewählte Färbemethoden für Botanik, Parasitologie, Zoologie" (https://www.waldeck-ms.de/wp-content/downloads/faerbemethoden_deutsch.pdf). Leider sind nicht mehr alle Chemikalien von der Firma erhältlich, weil sie offenbar zu selten angefragt wurden. Die Hochzeit mikroskopischen Präparate mit einer Vielzahl an histologischen Färbungen scheint vorbei zu sein, medizinische Institute machen heute vor allem Nachweisreaktionen und die anderen WissenschaftlerInnen in der Regel bestenfalls Standardfärbungen.

Beste Grüße
Birger

Edit: Link geändert und Leerzeichen herausgenommen, jetzt sollte er funktionieren.

[DieterS.]

Liebe Zoologen,

wie bereits beschrieben, hängt die Art der Fixierung und Konservierung vom Material ab aber auch von dem, was

im zoologisch-histologischen Präparat dargestellt werden soll. Zudem ist wichtig zu entscheiden, ob für die

Paraffin- oder die Semidünnschnitttechnik (oder Beides) bzw. die Elektronenmikoskopie vorbereitet werden soll.


Die größten Fehler, die gemacht werden, passieren aber (meiner Meinung nach) nicht durch die Fixierung und

Konservierung, sondern vor allem, durch eine nicht vorab durchdachte, im Extrem "kaotische" Probenent-

nahme. So sollte man vor einer Tötung und Eröffnung eines Tieres alle Gerätschaften (Scherem, Messer, usw.)

sowie die Behältnisse und Fixative, letztere passend abgefüllt, bereit gestellt haben. Des  Weiteren sollten

Fixieransätze auf 4 Grad Celcius vortemperiert bereitstehen (z.B. auf einer Aluminiumplatte mit Isolierung).

Ein entscheidender Punkt ist der Ablauf der Probenentnahme. Hierbei sollten zunächt die Organe und Gewebe mit

retikulärem Strukturen entnommen werden (z.B. periphere und zentrale lymphatische Organe; Milz, Lymphknoten,

usw.), während bei Hartgewebestrukturen ein geringerer Zeitdruck besteht. Nach der Fixierung, Auswaschung und Kon-

servierung ist eine Lackerung  der Proben in 70 bis 80 %igem Ethanol bei ebenfalls 4 Grad Celcius im Kühlschrank zu

empfehlen.


Ziel all dieser Maßnahmen ist es, den Zeitraum einer Autolyse nach dem Tod des Tieres möglichst kurz zu

halten, da hierbei vor allem die feinstrukturellen, histologischen Merkmale verloren gehen. Diese lassen sich

auch durch die "beste" Fixierung und Lagerung nicht  wiederherstellen. Liegt Material eines toten Tieres

vor, dass dann quasi Nachfixiert wird, darf histologisch nicht viel erwartet werden.

Viele Grüße!

Dieter

[rlu]

Hallo Dieter,

vielen Dank für die Hinweise.
Eigentlich ist es ja nachvollziehbar, dass die Fixierung kühl gehalten werden soll, bis der Fixierungsprozess abgeschlossen ist. Man möchte so wenig Störung und Abbau in die Strukturen reinbringen.

Habe mich mit einem Kollegen unterhalten.
Die kurze Antwort war die:

Fixierung mit AFE(Pflanzen): Auswaschen mit 70% Alkohol.
Fixierung mit Formol(tierisches Gewebe): Auswaschen mit Wasser. Dann zur Lagerung Entwässerung mit Alkoholstufen bis auf 70%.
In 70% Alkohol können die fixierten Proben lange aufbewahrt werden.
AFE(Alkohol-Formaldehyd-Eisessig)

Pikrinsäure soll Fettgewebe besser fixieren. Macht aber nur in der Literatur einen Unterschied.
AFE kann auch für histologisches Material verwendet werden.
Die Puristen werden vielleicht Einwände haben, wenn ja welche?

Liebe Grüße
Rudolf

[DieterS.]

Hallo Rudolf,

ich hatte in meinem Beitrag noch vergessen, etwas zur Lagerung der fixierten Proben zu schreiben; dass habe ich nun, nach dem ich Deinen Betrag gelesen habe, nachgetragen. Mit der von mir beschriebenen Vorgehensweise habe ich bisher immer gute Erfahrungen gemacht. Bei der Paraffinschnittechnik ist sicher mehr Spielraum bei der Präparation möglich als bei der Semidünnschnittechnik oder der Vorbereitung zur Elektronenmikskopie.

Viele Grüße!

Dieter

[M Beier]

Hallo Birger,
leider funktioniert der Link zu Waldeck und den Färbemethoden nicht mehr. Hast du das Dokument eventuell als PDF und könneste es einstellen?
LG Maria

[RainerTeubner]

Hallo Maria,
 
 bei mir funktioniert der Link: https://www.waldeck-ms.de/wp-content/downloads/faerbemethoden_deutsch.pdf, siehe Anlage

Viel Erfolg!

Rainer

[B.Neuhaus]

Liebe Maria,

nachdem ich ein Leerzeichen herausgenommen habe, das sich eingeschlichen hatte, funktioniert der Link auch wie gewünscht  .

Beste Grüße
Birger