Fustrated Total Internal Refexion (FTIR) Bilder

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
irgendwie haben mich Ramons Bilder von Anfang an begeistert. Ich stehe schon lange in Kontakt mit ihm  und er hat mir freundlicher Weise eines seiner "DIMOMOS" zur Verfügung gestellt. Damit experimentiere ich schon eine Weile und es wird Zeit, ein paar Ergebnisse zu zeigen.

Zuerst, was ist FTIR?
Bei der klassischen FTIR wird Licht unter dem Winkel der Totalreflexion auf das Objekt gestrahlt. Dabei ist das Objekt extrem nah an dem theoretischen Reflexpunkt. Da Licht keine Teilchen sind, sondern den Wellengesetzen gehorchen, sind die Lichtwellen in der Lage, etwas über den Punkt der Totalreflexion hinaus in  Richtung Objekt zu "tunneln". Wenn das Objekt dabei in irgendeiner Weise mit der Welle interagiert, kann sie nicht "zurück-tunneln". Die Totalreflexion wird "frustriert". Es gelangt Licht zum Objekt und dann ins Mikroskop, das eigentlich durch Totalreflexion gar nicht da sein dürfte. Die Eindringtiefe liegt dabei bei etwa 100 bis 200 nm.
Aber das macht Ramon ja gar nicht. Da er Öl oder ein anderes Immersionsmedium nutzt, um sein "DIMOMO" an den Objektträger zu koppeln, findet bei seinem Verfahren ja gar keine Totalreflexion statt. Und die Dicke eines Objektträgers ist auch viel größer als 200 nm. Für mich ist das eigentlich "nur" ein neues Dunkelfeldverfahren, mit zugegeben extrem flachen Einfallswinkeln.

Es handelt sich ja auch noch um einen Prototyen mit viel Bastelpotential. Zur Zeit erzeugt es leider noch recht viel Streulicht. Je höher die Objektivapertur, um so flauer wird das Bild. Zumindest ab einer bestimmten Aperturgröße und bei meinen Experimenten.

Bei meinen Experimenten habe ich ein LED-Band, Baumarktqualität, ohne Linsen, 12 V 150 mA verwendet. Ich habe sie nicht gezählt, aber das sind bestimmt 40 LEDs, die in den Lichtsammler einstrahlen. Dieses LED-Band habe ich auf einen Ring aus Lochblech (Gartenbedarf) geklebt, der das DIMOMO komplett umschließt. Das ist noch etwas wackelig, hat aber folgenden Vorteil: ich habe noch einen Ring mit blauen LEDs und violetten LEDs...

Alle Bilder sind nur mit dem weißen LED Band erstellt worden. Die Objektträger (oder der Chip im Auflicht) wurde immer mit Immersionsöl an das DIMOMO gekoppelt. Alle HI-Objektive sind natürlich immergiert gewesen. Alle Bilder sind nicht gestackt.

So, und jetzt viel Spaß beim Betrachten, Kommentare und vor allem Verbesserungsvorschläge sind erwünscht. Und Fragen nicht verboten :-)



Carsten

Habt etwas Gedult, es geht noch weiter.


Fangen wir technisch an:



Bild 1: Dünnschliff eines Kaiserstuhl-Carbonatits, Durchlicht, Planachromat HI 25x



Bild 2: Ein Chip aus meiner Sammlung, Auflicht, PlanApo 12,5

Anmerkung: Gegenwärtig ist Ramoms System bei Auflicht extrem eingeschränkt, da das DIMOMO AUF dem Objekt liegt und das Objektiv durch 2,8 mm Kunststoff sehen muss.

[Carsten Wieczorrek]

So, weiter geht es.

Die nächsten Bilder sind Diatomeen aus meiner historischen Sammlung. Das Präparat "The super slide".



Bild 3 : Diatomeen, Planachromat HI 25x



Bild 4 : Diatomee 1, Planachromat HI 25x



Bild 5 : Diatomee 2, Planachromat HI 25x



Bild 8 : Diatomee 2, Planapochromat HI 100x

Es geht noch weiter.

[Carsten Wieczorrek]

So, weiter geht es.

Die nächsten Bilder sind alle biologischen Ursprungs. Die Planzenschnitte sind gefärbt und bestimmt 6 Jahre alt. Die Epithelzellen sind frisch präpariert und in Wasser eingedeckt. Achtung, wer es nachmachen möchte: bei Hizefixierung sind die Zellen in dem Verfahrne unsichtbar.



Bild 7 : Epithelzellen in Wasser, Planachromat HI 25x



Bild 8 : Epithelzellen in Wasser, Planapochromat 50x



Bild 9 : Pflanzenschnitt, Planachromat HI 25x



Bild 10 : Pflanzenschnitt, Planachromat HI 25x



Gute Nacht
Carsten

[Spectrum]

Hallo Carsten,
In deinen Diatomeen-Aufnahmen, sieht man erneut diesen mysteriösen Grünstich.
Ich denke inzwischen, dass bereits das Licht auf der Beleuchtungsseite des Strahlengangs diese Farbe annimmt.
Also irgendwo auf dem Weg zwischen der LED und dem Objekt (in diesem Fall der ja eigentlich "farbneutralen" Diatomee).

Was denkst du?
Grüße Holger

[Carsten Wieczorrek]

Guten Morgen,
Ich vermute, das liegt an den Absorptionseigenschaften des PMMA. Das hat eine leichte Absorption im roten Bereich. Durch die Totalreflexion läuft das Licht recht lange Wege durch diesen Lichtsammler.
Carsten

[Sourdough]

Hi Carsten,

da ich mich für so ein Verfahren etas anstrengen müsste, wäre meine erste Frage: Was sieht man auf deinen Bidern, was ich mit Hellfeld, Ph, Dunkelfeld, etc. nicht sehen würde?

Soll natürlich keine Kritik sein, deine Bilder sind fein. Das Verfahren interessiert mich durchaus und ich habe die Beiträge dazu gerne gelesen. Meine Frage ist die eines typischen Minimalisten.

Viele Grüße
Michael

[Carsten Wieczorrek]

Hallo Michael,
das ist eine gute Frage. Ich habe ja geschrieben, ich halte das für eine Form des Dunkelfeldes. Wenn Du Dir aber Ramons Bilder ansiehst, dann sehen schon etwas anders aus als normales Dunkelfeld. Aber das ist eine Aufgabe: mal beides mit dem gleichen Gerät nebeneinander stellen. Mal sehen, ob das geht, ohne das Objekt zu bewegen.
Carsten

[anne]

Hallo Carsten,
ich könnte die Frage auch an anderer Stelle stellen bei Ramons Beitrag, aber ich tue mich mit dem realen Erkenntnisgewinn zumindest für diese Objekte schwer.
Was sollte man denn sehen, was man sonst, mit den gängigen Verfahren nicht sieht?
lG
anne

[Spectrum]

Hallo Carsten,
Auch ich fand diese Beleuchtungsmethode von Anfang an sehr interessant.
Ich hatte mich deshalb auch schon mit Ramon kurzgeschlossen.
Dieser grüne Farbstich (im amerikanischen Forum auch als "green stuff" bezeichnet), bzw grün leuchtende Bereichen in bestimmten Teilen des Bildes, hat mir ehrlich gesagt schon einiges Kopfzerbrechen bereitet.
Deine Erklärung klingt für mich von allen bisherigen Erklärungsansätzen am plausibelsten.

Noch zwei Fragen:
Ich habe bei dieser Beleuchtung den Eindrucks, dass es auch einen Unterschied macht wie weit ein mikroskopisches Objekt von dem ("beleuchteten") Objektträger entfernt ist.
Die Bereiche einer Diatomeen die direkt auf dem Glas aufliegen unterscheiden sich (so meine Eindruck) in der Abbildung von anderen Bereichen, die tiefer im Medium, also weiter weg von der Beleuchtungsseite liegen.
Möglicherweise auch was den Farbstich angeht.
Hast du dazu ähnliche Beobachtungen machen können? Oder täusche ich mich da, bzw handelt es sich da um sättigungsbedingte Artefakte des Kamerasensors?
Und zweitens:
Hast du mit den violetten LED's und einem Sperrfilter auch schon eindeutige Fluoreszens beobachten können?

Hallo Michael, Hallo Anne,
Ich sehe bei dieser Beleuchtungsmethode folgende praktische Vorteile:
-Du kannst ohne Kondensorwechsel sowohl sehr große Bereiche im Dunkelfeld betrachten als auch höhere Vergrößerungen nutzen.
Vom Übersichtsobjektiv bis zu höheren Vergrößerungen kannst du einfach hin- und herwechseln.
Mit klassischen Dunkelfeldkondensoren geht das nicht.
Da kommst du dann nur mit Frontlinsengeschwenke, bzw mit unterschiedlichen Dunkelfeldblenden oder gleich einem neuen Kondensor weiter.
Auch muss in der Regel für jedes Objektiv nochmal nachjustiert werden. Das fällt bei Ramons Aparillo komplett weg.
Von der Theorie her, müssten sogar hochaperturige Objektive nutzbar sein, aber da meinte Carsten ja schon das es ab einer gewissen Apertur zumindest mit der jetzigen Version eher flau aussieht, ich bin gespannt ob sich da noch mehr rausholen lässt.
-Du kannst jederzeit bequem zwischen Hellfeld und Dunkelfeld hin und her schalten. Simultan geht auch. Einfach indem du die entsprechenden Beleuchtung an und ausschaltet.
Auch das ist mit klassischen DF-Kondensoren so nicht möglich.

Es gibt auch bereits professionelle Systeme die auf einem ähnlichen Prinzip beruhen (auch wenn hier das Licht direkt in den Objektträger per Tatalreflexion eingespeist wird:

https://journals.plos.org/plosone/article/figures?id=10.1371/journal.pone.0058344

Bei Ramons Version geschieht das ja zumindest ähnlich über den Lichtleiter (Acryldiskus) der mittels Immersionsöl mit dem Objektträger gekoppelt ist.

Was den Mehrgewinn angeht, wäre neben den oben angeführten Vorteilen auch der extrem flache Einfallswinkel der Beleuchtung zu nennen. Das wäre vom Prinzip her ja sozusagen das andere Ende der Extreme beim Dunkelfeld, wenn ma es mit dem Grenzdunkelfeld/ringförmiges Dunkelfeld vergleicht.
Während beim Heine und Variokondensor sehr spitze Beleuchtungskegel genutzt werden (bis hin an die Grenze die überhaupt noch Dunkelfeld ermöglicht),  sind sie hier extrem flach.
Ob und in wieweit das bei bestimmten Objekten von Vorteil ist, müsste man ausprobieren.

LG Holger

[hugojun]

Hallo Holger,
Das Schema in deinem gelinkten Beitrag funktioniert nur,wenn zwischen Objektträger ,Objekt und Deckglas Luft befindet. Bei Verwendung von Klebern(z.B.Dünnschliffe)oder Flüssigkeit unter dem Deckglas kommt es erst garnicht zur Total Reflexion. Erst beim Licht Austritt am Deckglas?
Das Objektlicht ist also mithin reines Streulicht.

LG
Jürgen

[Spectrum]

Hallo Jürgen,
Bei den in dem verlinkten Beitrag dargestellten Präparaten handelt es sich um histologische Schnitte in Medium (ich nehme an physiologische Kochsalzlösung) kein Trockenpräparat.
Deine Frage bezieht sich bestimmt auf den Strahlengang in Schema B.
Dort wird (vereinfacht) die Tatalreflexion an einem, einzelnen Glas/Luft Übergang gezeigt.
Schema B erklärt also erstmal nur wie das Licht ohne Deckgkas, also nur im seitlich beleuchteten Objektträger mittels Totalreflexion Richtung Probe geleitet wird. Der Objektträger fungiert dabei im Prinzip wie eine Glasfaser.
Sobald das eingespeist Licht dann auf den Bereich unter dem Deckglas trifft wird's dann interessant.
Dort trifft das Licht nicht mehr auf auf Luft sondern auf das Sandwich aus Medium (Wasser, Eindeckmittel etc.), Probe und Deckglas.
Durch die geänderte Differenz der jeweiligen Brechungsindizes an der Stelle an der das Deckglas aufliegt verändern sich dann auch die Bedingungen für die Lichtbrechung des eingespeisten "Seitenlichts".
Dann wird auch die eigentliche Probe (hier zb. der dünnen Hirnschnitt) beleuchtet.
Das sollte dann kein reines "zufälliges" Streulicht mit allen möglichen Einfallswinkeln, sondern überwiegend sehr flach einfallendes Licht von der Seite sein.
Aber jetzt spielt das Licht nicht mehr nur zwischen zwei Glas-Luft Übergängen "Ping-Pong" sondern trifft auf das Eindeckmedium mit der Probe darin.
Wie genau das Licht dabei aus dem Glas des Objektträgers in das darüberliegende Medium übergeht wüsste ich auch mal gerne...
Da spielt bestimmt auch eine Rolle welche RI dort aufeinandertreffen (Stichwort Grenzwinkel).
Wird dieses überwiegend sehr flach von seitlich unten kommende Licht dann durch eine Struktur in der Probe, wie zb ein dünnes Neuron aus dem Hirnschnitt, in Richtung Objektiv abgelenkt, erscheint es dann hell vor dunklem Hintergrund... (Prinzipiell Dunkelfeld also).
So zumindest meine Interpretation.
Grüße Holger

[Ramon]

Hi guys, I asked the AI to translate to german from the original english

First, what is FTIR? ...

Carsten, vielen Dank für die Zeit, die du hier hineingesteckt hast, und dass du die Ergebnisse so offen zeigst. Zum Namen: Du hast recht. Durch die Ölkopplung wird das Präparat mit gewöhnlichem, sich ausbreitendem Licht beleuchtet, nicht mit einer evaneszenten Welle wie bei der klassischen TIRF. Für transparente Präparate ist ,,Dunkelfeld mit sehr hoher Beleuchtungsapertur" die treffendere Beschreibung: theoretisch NA 1,0–1,49, bisher nicht gemessen. Die Totalreflexion ist trotzdem das, was das Licht im Objektträger hält und von Trockenobjektiven fernhält. Das Öl hebt sie nur dort auf, wo der Lichtleiter den Objektträger berührt.

It's still a prototype ... and in my experiments.

Ideal wären einzelne LEDs mit kollimierenden oder bündelnden Linsen; ein solches Gerät habe ich auch. Das macht die Herstellung (CNC) aber deutlich teurer, deshalb habe ich mich für LED-Streifen entschieden und schirme das Streulicht ab. Ich helfe dir gern dabei, das Streulicht besser zu reduzieren.

Sind die LEDs, die du verwendest, die, die ich dir geschickt habe? Berühren die LEDs den Rand des Lichtsammlers? Der Ring aus Lochblech sollte auch als Kühlkörper wirken, was das Problem der LED-Erwärmung elegant löst. Gute Idee, Carsten!

Note: Currently, Ramom's system is extremely limited in reflected light, as the DIMOMO rests ON the object and the objective is separated by two...Must see 8 mm of plastic.

Du hast recht, dass das Objektiv durch den Lichtleiter hindurchschauen muss; es braucht daher einen langen Arbeitsabstand. Bei den Objektiven eines biologischen Mikroskops heißt das 5x und 10x. Nach meiner Erfahrung reichen diese für vieles: Kornstruktur, Gefüge und Einschlüsse in Metallen, Erzen und Mineralen sowie ältere ICs. Bei diesen Vergrößerungen ist die sphärische Aberration durch das Acryl nicht bemerkbar, besonders mit dem neueren 1,8-mm-Lichtleiter, und eine grobe Abschätzung bestätigt das. Mit Objektiven mit langem Arbeitsabstand (LWD) sind auch höhere Vergrößerungen möglich; ich verwende ein 20x-LWD-Objektiv, das mir Holger freundlicherweise überlassen hat, mit guten Ergebnissen.

I suspect this is due to the absorption properties of PMMA. It has a slight absorption in the red range. Because of total internal reflection, the light travels a fairly long path through this light collector.

Ich denke, hier werden zwei Dinge vermischt. In meinen Tests kam der gleichmäßige Grünstich über das ganze Bild hauptsächlich von den Kameraeinstellungen und der LED. PMMA absorbiert zwar etwas im Roten, aber auf einem weißen PTFE-(Teflon-)Target war ein LED-Streifen mit CRI 95 durch Lichtleiter und Objektträger nur etwa 2 % grüner als Halogenlicht, gegenüber etwa 14 % bei meinem früheren, billigen Streifen. Die LED und die Kameraeinstellungen spielen also ebenfalls eine Rolle.

Carsten, welchen Weißabgleich hast du verwendet? Und hast du das Kamerabild mit dem Blick durch die Okulare verglichen?

Durch das Okular ist der Grünstich bei mir fast verschwunden. Unten siehst du eine Diatomee: links das, was die Kamera aufzeichnet; rechts dasselbe Bild mit auf ein Drittel reduzierter Farbe, was dem Bild im Okular am nächsten kommt.

Ungültige Dateianhangs-ID.

Diese Diatomeen waren trocken: Die Bilder wurden am Tag nach der Präparation aufgenommen, als das Wasser vollständig verdunstet war.

What can I see in your pictures that I wouldn't see with brightfield, phosphor, darkfield, etc.?

could ask this question elsewhere in Ramon's post, but I'm struggling to grasp the real insights, at least for these objects.
What exactly would one see that one wouldn't see with conventional methods?

Michael und Anne: eine berechtigte Frage. Bei transparenten Präparaten sieht man Dunkelfeld-Information, und ich erwarte bei Diatomeen nichts Neues, was ein guter Dunkelfeldkondensor nicht auch zeigen würde. Ob die sehr hohe Apertur gegenüber einem Öl-Dunkelfeldkondensor etwas bringt, ist ungetestet; Carstens Vergleich nebeneinander ist genau das richtige Experiment.

Mir geht es aber nicht nur darum, was man sieht, sondern auch wie. Die meisten Hobbymikroskopiker haben ein biologisches Mikroskop, und für undurchsichtige Proben wie Metalle, Minerale oder Chips braucht man normalerweise ein zweites, metallurgisches Mikroskop. Mit dem Gerät kann dasselbe biologische Mikroskop sie betrachten. Es ist kein Ersatz: Es gibt kein Hellfeld mit senkrechtem Lichteinfall, nur sehr schräges Licht. Aber es öffnet die Tür zu undurchsichtigen Proben, ohne ein weiteres Mikroskop kaufen zu müssen.

Dasselbe gilt für die Kombination von Verfahren. Das Hellfeld kommt von der Mikroskoplampe, Dunkelfeld und Fluoreszenz von LED-Ringen. So kann man zwischen ihnen wechseln, ohne den Objektträger zu berühren, und die Bilder überlagern: Streuung, Absorption und Fluoreszenz derselben Strukturen. Ein voll ausgestattetes Mikroskop kann das auch; der Punkt ist, es mit einem einfachen zu tun. Die Fluoreszenz ist der am wenigsten ausgereifte Teil: Die Autofluoreszenz der Zellwände eines Farns wurde an einem professionellen Mikroskop bestätigt, aber ein richtiger Anregungsfilter fehlt noch. Ich habe dazu einen Beitrag geschrieben: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=54607.0

Richtung des Lichts. Noch ein Punkt, für Metalle. Das Licht tritt über LEDs rund um den Rand in den Lichtleiter ein, sodass man es nur von einer Seite oder sogar von einer einzelnen LED kommen lassen kann. In einem früheren Test habe ich eine geätzte C10-Stahlprobe aus einem Quadranten beleuchtet und den Lichtleiter in 30°-Schritten gedreht. Einzelne Körner wechselten mit der Richtung zwischen hell und dunkel, sodass sich Körner mit ähnlicher Facettenorientierung zu Domänen zusammenfassen ließen. Das ist das Prinzip der Directional Reflectance Microscopy (gerichtete Reflexionsmikroskopie, Seita und Mitarbeiter). Mit jeweils einem Quadranten und nur den flachen Winkeln, die der Lichtleiter liefert, ergibt das relative Orientierungsdomänen, keine echte Kristallographie. Ich bereite jetzt eine elektronische Steuerung vor, mit der jede der acht LEDs einzeln vom PC aus geschaltet und gedimmt werden kann. Das ersetzt das Drehen des Lichtleiters von Hand, und die Probe bleibt zwischen den Aufnahmen völlig unbewegt, was beim ersten Test die Hauptschwierigkeit war. Segmentierte Ringleuchten machen an metallurgischen Mikroskopen etwas Ähnliches; der Punkt ist auch hier, es an einem biologischen Mikroskop zu tun.

The areas of a diatom that are directly on the glass appear different (or so it seems to me) in the image from other areas that are deeper in the medium, i.e., further away from the light source.  Perhaps this also applies to the tint.

Nur eine Hypothese: In einem Wasserpräparat kann Licht oberhalb von NA 1,33 nicht ins Wasser eintreten und wird am Glas totalreflektiert; dort bleibt ein evaneszentes Feld, also die frustrierte Totalreflexion, die Carsten beschrieben hat. Teile einer Diatomee, die auf dem Glas aufliegen, könnten daher zusätzliches Licht bekommen. Die Diatomeen in meinem Bild oben waren trocken, und in Luft kann keine Beleuchtung das Glas verlassen; die Schalen können also nur dort Licht aufnehmen, wo sie das Glas berühren oder fast berühren. Das passt zu deiner Beobachtung, ist aber noch offen, und eine Sättigung des Kamerasensors könnte auch eine Rolle spielen.

Also, you usually have to readjust for each objective. This is completely eliminated with Ramon's device.
In theory, even high-aperture objectives should be usable, but Carsten already mentioned that the image quality becomes rather weak above a certain aperture, at least with the current version. I'm curious to see if more can be achieved.

Gerade eben habe ich eine Diatomee mit dem 100x-Ölobjektiv NA 1,3 betrachtet, und das Bild war ziemlich gut.

Thanks a lot for your time guys
Ramon

PD I hope the translation is OK if there are doubts I can post it in english

[Ramon]

THe missing image from my last post is this one

[Ramon]

Hi again, it seems that my german translator is not doing a proper job, find the post in english here

First, what is FTIR? ... admittedly with extremely shallow angles of incidence.

Carsten, thank you for the time you've put into this and for showing the results so openly. On the name: you are right. With the oil coupling, the specimen is lit by ordinary propagating light, not by an evanescent wave as in classic TIRF. For transparent specimens, "darkfield with a very high illumination aperture" is the more accurate description: in theory NA 1.0–1.49, not yet measured. Total reflection is still what keeps the light in the slide and out of dry objectives. The oil only cancels it where the guide touches the slide.

It's still a prototype ... in my experiments.

The perfect scenario is to use discrete LEDs with collimating or convergent lenses, I have one gadget of this kind. But that makes it way more expensive to manufacture (CNC) so I decided to use LED strips and shade the stray light. I will help you better reducing the stray light.

Are the LEDs that you are using the ones I sent you? Are the LEDs touching the rim of the collector? The perforated metal ring should also work as a heat sink, which neatly solves the LED heating problem. Good one Carsten

Note: Currently, Ramom's system is extremely limited in reflected light, as the DIMOMO rests ON the object and the objective is separated by two...Must see 8 mm of plastic.

You are right that the objective has to look through the guide, so it needs a long working distance. With the objectives of a biological microscope that means 5x and 10x. In my experience these are enough for a lot of work: grain structure, textures and inclusions in metals, ores and minerals, and older ICs. At these magnifications the spherical aberration from the acrylic is not noticeable, especially with the newer 1.8 mm guide, and a rough estimate agrees. With long-working-distance objectives, higher magnifications work too; I use a 20x LWD courtesy of Holger, with good results.

I suspect this is due to the absorption properties of PMMA. It has a slight absorption in the red range. Because of total internal reflection, the light travels a fairly long path through this light collector.

I think two things may be mixed here. In my tests, the uniform green tint over the whole image came mostly from the camera settings and the LED. PMMA does absorb slightly in the red, but on a white PTFE (Teflon) target, a CRI-95 LED strip through guide and slide came out only about 2% greener than halogen, against about 14% for my earlier cheap strip. So the LED and the camera settings also matter.
Carsten, which white balance did you use? And have you compared the camera image with the view through the eyepieces?
I find that through the eyepiece the green tint is almost gone. Below you can see a Diatom, the left side is what the camera records; the right side is the same image with the colour reduced to one third, which comes closest to what I see through the eyepiece.



These diatoms were dry: the images were taken the day after the preparation, when the water had evaporated completely.

What can I see in your pictures that I wouldn't see with brightfield, phosphor, darkfield, etc.?

What exactly would one see that one wouldn't see with conventional methods?

Michael and Anne. A fair question. For transparent specimens, what you see is darkfield information, and I don't expect new things in diatoms that a good darkfield condenser wouldn't show. Whether the very high aperture adds anything over an oil darkfield condenser is untested; Carsten's side-by-side comparison is exactly the right experiment.

But what matters to me is not only what you see, but how. Most hobbyists have a biological microscope, and opaque samples such as metals, minerals or chips normally need a second, metallurgical microscope. With the gadget, the same biological microscope can look at them. It isn't a replacement: there is no normal-incidence brightfield, only very oblique light. But it opens the door to opaque samples without buying another microscope.

The same goes for combining methods. Brightfield comes from the microscope's lamp, and darkfield and fluorescence from LED rings, so you can switch between them without touching the slide and overlay the images: scattering, absorption and fluorescence of the same structures. A fully equipped microscope can do this too; the point is to do it on a basic one. Fluorescence is the least mature part: fern cell-wall autofluorescence has been confirmed on a professional microscope, but a proper excitation filter is still missing. I made a post on the topic https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=54607.0

Direction of the light. One more point, for metals. The light enters the guide from LEDs around its rim, so it can be made to come from one side only, or even from a single LED. In an earlier test I lit an etched C10 steel sample from one quadrant and rotated the guide in 30° steps. Individual grains switched between bright and dark as the direction changed, so grains with similar facet orientation could be grouped into domains. This is the principle of directional reflectance microscopy (Seita and co-workers). With one quadrant at a time and only the flat angles the guide provides, it gives relative orientation domains, not real crystallography. I'm now preparing an electronic control so each of the eight LEDs can be switched and dimmed separately from the PC. That replaces rotating the guide by hand, and the sample stays perfectly still between images, which was the main difficulty in the first test. Segmented ring lights do something similar on metallurgical microscopes; the point here is again to do it on a biological one.

The areas of a diatom that are directly on the glass appear different (or so it seems to me) in the image from other areas that are deeper in the medium, i.e., further away from the light source.
Perhaps this also applies to the tint.

Only a hypothesis: in a water mount, light above NA 1.33 cannot enter the water and is totally reflected at the glass, leaving an evanescent field there: the frustrated total internal reflection Carsten described. Parts of a diatom touching the glass may therefore get extra light. The diatoms in my image above were dry, and in air none of the illumination can leave the glass, so the frustules can only pick up light where they touch or nearly touch it. That fits your observation, but it is still open, and camera saturation could play a part too.

In theory, even high-aperture objectives should be usable, but Carsten already mentioned that the image quality becomes rather weak above a certain aperture, at least with the current version. I'm curious to see if more can be achieved.

Just now I was looking at a diatom with the 100x NA 1.3 oil objective and the image was pretty good.

Thanks a lot for your time, guys.
Ramon