Färbung für Pilzhyphen in Blattquerschnitten

[Hyperion]

Hallo,

ich möchte Blattquerschnitte von in vitro Pflanzenkulturen zur Qualitätsicherung auf Pilzbefall untersuchen.

An meinen Pflanzen zeigen sich von Zeit zu Zeit Nekrosen an den Blättern. Um zu überprüfen ob diese von Pilzbefall durch biotroph / nekrotroph lebende Pilze herrühren, dachte ich daran Blattquerschnitte irgendwie anzufärben um Haustorien / Hyphen im Querschnitt (durch die nekrotischen Stellen) sichtbar zu machen.

Biotrophe Pilze würden die Pflanze nicht umbringen, sondern lediglich schwächen (weniger Wachstum, Nekrosen, Chlorosen usw.), sodass ein Befall der Kulturen nicht unbedingt sofort ins Auge springt (könnte ja auch an fehlerhaften Medium liegen usw.).

Nun bin ich kein Pilzer und bräuchte folglich ein wenig Rat.

Ich dachte an eine wie auch immer geartete Färbung des einfachen Rasierklingenschnittes und Auswertung im 40er Hellfeld auf sichtbare Hyphen usw.

Hat einer eine Idee?

Beste Grüße Dominik

[Klaus Herrmann]

Hallo Dominik,

dafür gibt es die Pianese-Färbung. Habe ich, aber selbst noch nicht ausprobiert.

Beschreibung bei Chroma: Färbemethoden

[Hyperion]

Vielen Dank Klaus!

Bei Aeisner habe ich die Anleitung uach gefunden.

http://www.aeisner.de/methoden/farb118.html

Jetzt muss ich nur noch rausfinden ob das auch ohne Paraffin und Einbetten in Harz funktioniert.

[Klaus Herrmann]

Hallo Dominik,

Jetzt muss ich nur noch rausfinden ob das auch ohne Paraffin und Einbetten in Harz funktioniert.

Es wäre sehr verwunderlich, wenn die Paraffineinbettung und die letztliche Harzeinbettung einen Einfluss auf das Färbeergebnis hätten.

[Horst Wörmann]

Hallo Dominik,

wenn Sie die Möglichkeit zur Fluoreszenzmikroskopie haben, geht das sehr einfach und selektiv mit dem Farbstoff "Mykoval" bei
365 nm Anregung (LED z.B.).
Das geht sowohl bei Handschnitten als auch bei Paraffinschnitten, siehe Fotos. Es handelt sich um Längsschnitte einer "Ambrosia"-Galle, die innen mit einem
Pilzmycel ausgekleidet ist.


Pflanzengalle quer, Paraffinschnitt, angefärbt mit Mykoval, 365 nm Fluoreszenz-Auflicht.


Hellfeld Durchlicht


Durchlicht und Auflicht-Fluoreszenzbilder überlagert.

Die technischen Daten möchte ich weglassen, es geht ja nur um die Färbung.
Der Mykoval-Farbstoff (ein Stilben-Derivat) ist nicht ganz selektiv, färbt auch die Zellulose etwas an, siehe die Kringel oben im Fluoreszenzbild.
Dazu gibt es mehrere Artikel im Mikrokosmos.
Sehr selektiv geht es mit Wheat Germ Agglutinine gekoppelt mit Alexa 488. Aber das ist teuer, und da forsche ich noch dran.
Literatur und weitere Informationen zu dem ganzen Kram auf Wunsch.

Hoffe, das hilft,
viele Grüße
Horst Wörmann

Nachträglich geändert: muß natürlich 365 nm Anregung heißen, nicht 470 nm.

[Holger Adelmann]

Hallo Dominik,

Im Krauter, Mikroskopie im Alltag, wird dafür Orseillin BB angegeben.

Viele Grüsse
Holger

[reblaus]

Hallo Herr Wörmann -
wie kriegt man diese schöne blaue Fluoreszenz bei 470 nm Anregungslicht hin? Das suche ich schon lange!
Viele Grüße
Rolf Blaich

[Hyperion]

Vielen Dank für die Anregungen (auch für die per PN erfolgten)!

Anscheinend gibt es da eine ganze Menge Färbemöglichkeiten für Pilze in Pflanzen.

Sachen wie Antikörper sind ziemlich cool, bekomme ich bei unserer Budgetlage aber niemals genehmigt. Ich kann froh sein, wenn ich wenige Gramm der Farbstoffe bestellen darf.
Wie teuer ist denn Mykoval, ein Fluoreszenzmikroskop hätten wir.

Ich werde daher nächste Woche mal die genannten Färbungen ausprobieren und schauen was bei rauskommt.

Dann noche ine Frage: Sieht man Stäbchen wie Pseudomonas mit dem 40er im Phako? Die können nämlich auch Nekrosen machen...

[Horst Wörmann]

Lieber Herr Blaich,

vielen Dank für den Hinweis - Blauanregung und Blaufluoreszenz geht natürlich nicht. Muß heißen 365 nm Anregung,
aber auch mit LED. Sobald ich herausgefunden habe, wie man das ändert, wird das im Beitrag korrigiert.

Lieber Dominik,

Mykoval wird von Fa. Jülich in Bonn vertrieben, ich habe Kosten von rund 100 EUR pro 10 ml im Gedächtnis (aus 2006).
Andere Namen: "Diäthanol", Uvitex 2 B, Fungiqual A, und viele andere Trivialnamen. Anregung 390 bis 420 nm, Emission 450 nm.
Mikrokosmos 83 (1994), S. 103.

Viele Grüße,
Horst Wörmann

[Bernhard Kaiser]

Hallo Dominik,

Fixieren Ihrer Schnitte in Rawlins-Fixierlösung:
100 ml Äthanol 50%;
  10 ml Formalin ca. 35%
  10 ml Essigsäure 10%

Fixierdauer 48 Std. auswaschen in Äthanol50% bis Essigsäuregeruch verschwunden ist.
Besonders geeignet für Pilze in Pflanzengeweben!

Lit.:  Schubert, Handtke, Pankow (1983): in Exkursionsflora DDR und BRD. Bd.1 Niedere Pflanzen. Begründet von Rothmaler, W. Berlin

Färben würde ich mit Baumwollblau in ca. 80% Milchsäure. Ich habe dieses Verfahren nocht nicht ausprobiert. Wenn es klappt, einfach und billig.

Freundliche Grüße
Bernhard Kaiser

Wenn Sie kein Baumwollblau=Anilinblau bekommen, schicken Sie mir Ihre Postadresse. Ich schicke Ihnen etwas.